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阳离子聚合物修饰的埃洛石纳米管作为基因载体治疗癌症及其体内外毒性的研究

作者:龙哲儒
  • 作者:龙哲儒
  • 学位授予单位:暨南大学
  • 授予学位:硕士
  • 需要金币:10
  • 添加日期:2019-04-13 14:30
  • 下载地址:无链接信息!
论文介绍及目录
利用纳米材料独特的性质将其设计为非病毒载体治疗癌症的研究,是近年来纳米材料和癌症治疗的研究热点之一。本论文将天然无机纳米材料-埃洛石纳米管(HNTs)用阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)和聚酰胺胺(PAMAM)进行修饰,系统研究了其作为基因载体对癌症的体内外治疗效果。进而用斑马鱼模型对HNTs的体内外毒性进行了系统的研究。具体内容如下:(1)设计了一种基于PEI修饰HNTs(PEI-g-HNTs)的非病毒基因载体。为了增加入胞效率,HNTs首先通过短管化处理来减小尺寸,然后接枝PEI来作为递送绿色荧光蛋白(GFP)标记的质粒DNA(pDNA)的载体。PEI-g-HNTs的结构形态和物理化学性质通过多种测试方法来表征。实验证明PEI-g-HNTs比PEI具有更低的细胞毒性。带正电荷的PEI-g-HNTs能在氮磷比为5:1到40:1的范围内稳定结合pDNA。对于293T和HeLa细胞,在相同的氮磷比下,PEI-g-HNTs/pDNA络合物比PEI/pDNA络合物拥有更高的转染效率。在氮磷比20:1时,PEI-g-HNTs/pDNA络合物对HeLa细胞的转染率可以达到44.4%。蛋白质印迹法表明PEI-g-HNTs/pDNA络合物比PEI/pDNA络合物拥有更高的GFP蛋白表达。实验结果表明PEI-g-HNTs是一种新颖的基因载体,它具有很好的生物相容性和很高的转染效率,在癌症的基因治疗中有着广阔的应用场景。(2)构建了PAMAM修饰的HNTs(PAMAM-g-HNTs)用于siRNA递送治疗乳腺癌的新型非病毒基因载体。多种表征方法证明了PAMAM-g-HNTs的成功制备,改性后的HNTs表面带有+19.8 mV的电荷,具有负载基因的能力。同时用细胞毒性实验证明了PAMAM-g-HNTs良好的细胞相容性。细胞转染实验结果表明乳腺癌细胞(MCF-7)对PAMAM-g-HNTs/siRNA有着很高的细胞摄入水平,远远高于Lipo2000转染试剂。细胞凋亡实验也证实了PAMAM-g-HNTs/siVEGF比Lipo2000/siVEGF有着更好地诱导细胞凋亡能力。小鼠动物实验表明,PAMAM-g-HNTs/siVEGF的体内抗癌效果非常明显,高于Lipo2000/siVEGF。同时PAMAM-g-HNTs/siVEGF基因递送系统不会对小鼠其他主要器官造成副作用影响。体内影像学分析结果表明PAMAM-g-HNTs能够缓慢释放siVEGF的作用。所有结果表明PAMAM-g-HNTs是一种高效的基因载体,能够在体内和体外对乳腺癌进行有效地抑制。(3)用细胞和斑马鱼模型对HNTs的体内和体外毒性进行了研究。为了更加清晰地观察HNTs在斑马鱼体内的分布情况,HNTs用异硫氰酸荧光素(FITC)进行了标记。细胞毒性实验、细胞凋亡法和活性氧测试法都表明HNTs对人体正常细胞和癌细胞都具有很好的细胞相容性。当HNTs(200μg/mL)与细胞培育72小时后,细胞的活性依然高于60%。激光共聚焦显微镜观察到FITC-HNTs被细胞摄入的情况。斑马鱼模型实验表明不同浓度的HNTs对斑马鱼胚胎和幼体没有急性毒性,同时浓度小于25 mg/mL的HNTs还能促进斑马鱼的孵化。电镜实验观察到HNTs能富集在斑马鱼胚胎卵膜上,但对斑马鱼胚胎没有毒副作用。实验结果表明,HNTs被斑马鱼吞食后主要分布在其胃肠道,同时还能被斑马鱼排泄出去。所有的结果表明,HNTs是一种环境友好型的纳米材料,它在各个领域的发展应用是相对安全的。

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