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从生物信息学方法从多种角度定义近端和远端结肠癌的差异分子表达

作者:2018-10-01 01:02文章来源:未知

     摘要:目的:通过分析近端与远端结直肠癌的差异基因集和其集中的关键通路, 区分不同部位结肠癌的分子表达特征基因谱。方法:利用GEO数据库中高通量基因芯片数据筛选出具有结肠癌患者肿瘤部位近远端信息的芯片。采用GO基因功能注释和KEGG通路富集分析, 筛选出可表征远端与近端结肠癌生物特性的特征基因簇和通路, 并进行蛋白质相互作用网络可视化分析。结果:经差异基因分析后, 发现不同部位结肠癌基因表达具有显著差异, 且主要存在于一些重要的肿瘤相关信号通路, 如Wnt信号通路, 细胞外基质相关通路和免疫调控通路等。结论:本文利用生物信息学方法, 从多种角度定义了近端和远端结肠癌的差异分子表达特征, 为结肠癌的精准治疗提供理论依据。

  关键词:近端结肠癌; 远端结肠癌; 差异基因; 生物信息学分析;

生物信息学

  Study on the differences gene between proximal and distal colon cancer based on GEO database by bioinformatics

  ZHANG Yiwen LOU Qianwen ZHONG Like PAN Zongfu FANG Luo HUANG Ping

  Department of Pharmacy, Zhejiang Cancer Hospital School of Pharmacy, Zhejiang University City College

  Abstract:

  AIM: To investigate the distinguish differences gene and its key pathways by analyzing the microarray data of the colon cancer patients with location information. METHODS: Gene expression profiles of the colon cancer with the information of location information in GEO database were selected.Then, using the GO gene functional annotation and KEGG pathway enrichment analysis, screening can represent different characteristics of location of colon cancer gene cluster & pathway, and visualization analysis for protein interaction network. RESULTS:After bioinformatics analysis, it was found that location affected the biological characteristics of colon carcinoma, and significantly altered some important tumor signaling pathways, such as Wnt signaling pathway, extracellular matrix related pathways and immuno-regulatory pathways. CONCLUSION:This study employed bioinformatics method from various perspectives to define the gene expression characteristics of different location in colon carcinoma.These results may provide theoretical basis for accurate treatment of colon cancer.

  Keyword:distal colon cancer; proximal colon cancer; differential gene expression; bioinformatics;

  结直肠癌 (CRC) 是临床常见的消化道恶性肿瘤, 且其发病率和死亡率均在逐年增加, 严重威胁着人类健康。据国家癌症中心统计, 2015年我国新增结直肠癌患者约37.6万人, 死亡患者高达19.1万人。基于结直肠肿瘤的异质性, 如何对其实现精准治疗已成为亟待解决的难题[1]。

  近年来, 大量临床研究发现结直肠癌发生的部位不同, 其化疗敏感性和预后均存在较大差异[2-6]。其中, 2016年ASCO会议中CALGB/SWOG 80405研究的亚组分析结果显示, 对于KRAS野生型转移性结直肠癌 (m CRC) 一线FOL-FOX或FOLFIRI方案联合贝伐珠单抗或西妥昔单抗在结肠癌不同原发肿瘤位置对患者的总生存期 (OS) 和无进展生存期 (PFS) 具有显著影响[2]。

  基础研究表明结肠的不同位置来源于不同胚层。右半结肠起源于中肠, 由肠系膜上动脉供血;而左半结肠起源于后肠, 由肠系膜下动脉供血[7]。上述差异以及生理学和肠道微生物不同, 导致结肠癌发生体细胞突变、表观遗传变异和蛋白异常表达等大量分子事件时具有显著差异, 最终使得近端和远端结直肠癌具有不同的分子病理特征。目前, 已明确TP53, KRAS, BRAF以及EG-FR等关键基因的突变情况存在显著差异[4]。然而, 对于不同部位结肠癌的全基因组差异网络和蛋白功能簇仍尚待挖掘。

  基于上述差异, 我们利用GEO (gene expression omnibus) 数据库中已知肿瘤发生部位的芯片数据进行分析。拟通过筛选近端与远端结直肠癌的差异基因集和差异基因集中的关键通路, 以建立区分不同部位结肠癌的分子表达特征基因谱, 识别关键的分子事件和路径, 为结肠癌的精准治疗提供理论依据。

  1 材料与方法

  1.1 基因表达谱芯片筛选

  利NCBI (National Center for Biotechnology Information) 平台下的GEO数据库进行芯片筛选, 目标芯片需满足如下筛选标准: (1) 患者结肠癌标本, 排除细胞株和动物; (2) 入选芯片需具有结肠癌位置 (近端或远端) 信息; (3) 需为基因表达芯片, 各探针具有归一化的表达值; (4) 所纳入需符合质量要求的芯片, 芯片质量采用R语言 (http://bioconductor.org/bioc Lite.R) 中affy PLM语言包对芯片数据集进行回归分析判断。

  1.2 差异基因筛选

  对所筛选出的芯片进行数据下载及差异基因筛选。利用在线工具GEO2R (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/) 分析各个芯片, 选取P<0.05, 差异大于2倍的基因为候选差异基因探针, 并将探针转化为标准基因名称。

  1.3 基因功能注释与通路富集分析

  选取“1.2”部分所筛选出的差异基因, 利用DAVID生物信息资源数据库 (https://david.ncifcrf.gov/, 版本6.8) 进行在线分析工具, 以人源基因为背景进行GO (gene ontology) 基因功能注释和KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes) 通路富集分析, 筛选出可表征远端与近端结肠癌生物特性的特征基因簇和通路。

  1.4 蛋白相互作用网络分析

  应用Cytoscape3.5.1 (版本6.8) 的蛋白相互作用网络分析插件MCODE (Version 1.4.2, Bader Lab, University of Toronto) 对构建的生物学网络中的区域进行关联度分析。通过分析网络结构, 根据关联积分值, 可获得整个网络中可能形成的蛋白质簇和关键节点蛋白, 并在Cytoscape中进行可视化显示。

  2 结果

  2.1 患者基本信息

  经筛选及芯片质量分析, 共筛选出3个符合入选标准的芯片系列, 分别为GSE2138, GSE18088和GSE25070[8-10]。对其Matrix文件所提供相关患者基本信息进行分析, 共纳入125名患者, 基本情况见Tab.1。

  Tab.1 The baseline characteristics of patients (n=125)

  *MSI status:microsatellite instability.

  2.2 近段远端结肠癌差异基因功能注释结果

  通过差异基因的功能注释后, 分析出差异基因主要集中在细胞对低氧和代谢物如脂肪酸的应答, 与RNA聚合酶II相关的启动子负调控, 转录共激活物活性及其转录因子序列特异性结合DNA的活性, 以及一些细胞行为学相关过程, 如细胞膜参与的钙非依赖性细胞粘附, 细胞-基质附着力以及核质穿梭等 (Fig.1) 。

  2.3 近端远端结肠癌差异基因通路富集结果

  通过对近端远端结肠癌差异基因的通路富集, 我们发现其主要集中在肿瘤相关信号通路, 与细胞附着相关的黏着斑, Wnt信号通路和调控干细胞多能性的信号通路。还有免疫相关的通路, 如抗原的加工和递呈, 白细胞跨内皮迁移和自身免疫系统疾病, 以及代谢相关通路, 如丙氨酸、精氨酸和谷氨酸代谢 (Fig.2) 。

  Fig.1 The gene functional annotation of proximal and distal colon cancer

  Fig.2 The pathway enrichment analysis of proximal and distal colon cancer

 

  2.4 蛋白相互作用网络可视化分析

  通过对蛋白-蛋白相互作用进行评分, 做出可视化网络, 发现基于前述通路中的富集基因其翻译蛋白相互作用网络主要存在于以下三个集群, E3连接酶的泛素化过程, 蛋白激酶相关和代谢相关通路 (Fig.3) 。

  Fig.3 The visualization analysis of protein interraction network of proximal and distal colon cancer

  3 讨论

  结肠癌作为腹部常见恶性肿瘤, 其发病率呈逐年上升趋势。随着精准医学时代的到来, 结肠癌的诊疗从早期的MSI (微卫星不稳定) 状态到后来的分子标志物Ras家族以及BRAF等突变的发现, 其分子分型日益明确[11-13]。然而, 近年来大量临床试验逐渐证实, 除上述基因突变外, 其发生的部位不同对治疗和预后也具有重要意义。

  本研究通过GEO数据库检索获得了具有结肠癌原发灶位置信息的患者基因芯片125例, 通过分析每例患者的注释信息, 根据肿瘤发生部位将上述患者分为近端结肠与远端结肠两组进行比较, 通过对基因芯片进行表达谱差异分析, 基因功能注释和通路富集, 最终筛选出不同部位结肠癌发生发展过程中关键差异通路, 并对其蛋白相互作用进行可视化作图。

  本研究发现, 不同发生部位的结肠癌在分子特征和生物学行为, 尤其是一些肿瘤恶性演进和侵袭转移相关的基因上具有显著影响, 且通路富集和蛋白相互作用的结果也验证了前述功能的差异。一方面, 不同发生部位的结肠癌在黏着斑, Wnt信号通路和调控干细胞多能性等经典的肿瘤相关信号通路具有显著差别。这些信号通路直接或间接调控细胞活动, 如粘附、迁移、分化、增殖和细胞凋亡[14-16]。上述行为已被证实在肿瘤的恶性演进、上皮-间质转化中具有重要意义, 提示对于不同发生部位的结肠癌可能具有不同的抗肿瘤药物作用靶点[17-20]。

  另一方面, 慢性炎症作为结肠癌的一个已知致病因素被认为与结肠癌的发生发展直接相关。而经差异基因通路富集分析发现, 不同发生部位的结肠癌在免疫相关通路上的差异提示在相同炎症环境下, 不同部位的结肠癌的免疫应答可能不同。同时, 免疫治疗作为结肠癌治疗的新手段, 其疗效的发挥与免疫应答密切相关, 本研究结果提示不同发生部位结肠癌患者对于免疫治疗的应答可能不同。其是否存在疗效差异, 仍需临床试验进一步证实[21]。

  综上所述, 本研究利用多种生物信息学方法从不同的角度定义了不同发生部位结肠癌患者分子发病机制的表达特征, 证实了可在分子水平影响结肠癌的发生发展。本研究结果在基因层面为不同发生部位作为结肠癌患者分型提供了一定的支持, 也为结肠癌的精准治疗提供新思路。

  参考文献
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