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对促红细胞生成素糖基化分析方法的研究

作者:2018-08-02 01:07文章来源:未知
  促红细胞生成素 (erythropoietin, EPO) 是一种高度唾液酸化的糖蛋白类激素, 造血细胞因子超家族成员之一[1]。人体中的EPO绝大部分由肾脏产生, 主要功能是促进红细胞的生成, 提高机体血红蛋白的浓度。EPO通过结合其受体 (erythropoietin receptor, EPOR) 而发挥作用, 诱导受体构象的改变, 从而激活下游的磷酸化信号通路[2]。1988年出现了与天然EPO活性几乎相同的重组EPO (recombinant human erythropoietin, r Hu EPO) 产品, 迅速成为一种应用广泛的生物工程类药物[3]。临床上主要用于治疗各种疾病引发的贫血, 包括慢性肾衰竭、癌症及AIDS等。r Hu EPO能明显改善机体携氧能力, 增强人的耐力, 减少机体的运动性疲劳。因此, EPO也是一种激素类兴奋剂, 被滥用于一些耐力性比赛中。
  1989年, Amgen公司研制的epoetin alfa (Epogen) 是第一个进入市场的EPO制品。1997年, 罗氏公司的epoetin beta (Neo Recormon) 被欧洲药品管理局 (EMA) 批准上市。这两者均是通过人促红细胞生成素基因转染中国仓鼠卵巢细胞 (CHO) 表达获得[4]。随后, 第1代EPO包括epoetin delta、epoetin omega及epoetin theta被研制成功, 其内源性的EPO具有相同的氨基酸序列, 但不同制品间存在糖基化差异。第1代EPO半衰期相对较短, 需要每周给药1~3次, 给患者带来不便。2001年, Amgen公司研制的长效EPO制剂新红细胞生成刺激蛋白 (novel erythropoiesis stimulating protein, NESP) , 又称为darbepoetin alfa, 商品名为Aranesp的NESP已被FDA和EMA批准上市[5]。NESP是r Hu EPO高度糖基化的类似物, 通过氨基酸的定点突变, 在30和88位额外增加了2个N-糖基化位点。与epoetin alfa相比, NESP对EPOR的亲和力降低, 使其在体内的半衰期延长3~4倍。2007年, 罗氏公司的持续性促红细胞生成素受体激活剂 (continuous erythropoietin receptor activator, CERA) 被EMA批准上市[6]。CERA是在epoetin beta分子的氨基酸位置Ala1、Lys45者Lys52上连接甲氧基聚乙二醇获得, 是一种聚乙二醇修饰的r Hu EPO。相对分子质量约60 000, 体内半衰期长达130~140 h。NESP和CERA被称为第二代EPO, 具有更长的半衰期和更高的生物活性。
  近年来, 第一代原研EPO药物专利到期, 生物仿制药 (biosimilars) 的研发快速发展[7]。目前, 在欧洲和日本分别有2个和1个EPO生物仿制药被批准上市。随着第二代EPO药物专利保护即将到期, EPO生物仿制药市场将进入一个新局面。然而与小分子药物不同, 蛋白类药物不仅相对分子质量较大, 结构复杂, 且存在蛋白翻译后修饰, 如糖基化的存在, 使其结构高度不均一。同时对于仿制药研发和质量控制中, 证明其与原研药的一致性或相似性是关键问题, 需开发合理的分析方法。
  
  1 EPO糖基化修饰形态与生物活性的关系
  
  内源性EPO是由165个氨基酸组成的多肽, 同时含有3个N-糖基化位点和1个O-糖基化位点[8]。糖链约占总分子量的40%, 对其体内的生物活性有较大影响。最重要的糖基化影响因素是EPO唾液酸的含量, 未发生唾液酸修饰的糖链, 末端裸露的半乳糖会被肝脏半乳糖受体识别, 从而快速被清除。进一步研究表明, 唾液酸如果发生了O-乙酰化修饰, 其保护作用也会增强。因此, 对于EPO生产商而言, 需要最大程度地保证蛋白唾液酸化和乙酰化修饰。第1代EPO, 每个分子最多可能含有14个唾液酸和28个O-乙酰基, 而第2代NESP由于含有5个N-糖基化位点和1个O-糖基化位点, 最多可能含有22个唾液酸和44个O-乙酰基, 使NESP在体内的半衰期大大延长[5]。EPO中糖链的天线类型是影响其活性的另一个重要因素。研究表明, 低天线结构的糖链与高天线结构的糖链相比, 体内生物活性更低[9]。连接有N-乙酰半乳糖胺 (Lac NAc) 的糖链也会进一步降低EPO的体内活性, 这主要是由于其空间位阻降低, 易被半乳糖受体识别而被从血液中清除。
  除了考虑糖基化修饰对EPO生物活性的影响, 药物的安全性和潜在的副作用也是质量控制的关键。在哺乳动物中, 最常见的唾液酸是N-乙酰神经氨酸 (N-acetylneuraminic acid, Neu5Ac) 和N-羟乙酰神经氨酸 (N-glycolylneuraminic acid, Neu5Gc) 。而人体中不能合成Neu5Gc, 同时含有抗Neu5Gc的抗体[10]。而来源于CHO细胞系的EPO, 往往同时含有这两种唾液酸形式。因此, 需要对EPO中唾液酸的类型和含量进行详细分析, 保证具有较低含量的Neu5Gc。同时, 也需要分析EPO中是否存在一些不完整或不正确的糖链。例如, 在商品化的EPO制剂中, 磷酸化的高甘露糖的糖链是一种常见的副产物。目前, 对于这种高甘露糖链对EPO的药代动力学的影响尚未有研究报道。
  
  2 EPO糖基化修饰形态的分析方法
  
  2.1 完整蛋白的分析
  
  等电聚焦法 (isoelectric focusing, IEF) 是常见的一种蛋白质分析方法, 基于所带电荷不同实现分离。由于EPO中带负电荷的唾液酸对其生物活性有重要影响, IEF已被广泛应用于EPO异构体的分离中, 特别是兴奋剂检测中[11]。二维电泳 (2-DE) 是一种同时基于电荷和分子量的蛋白分离方法, 也被应用于EPO异构体的分离中。毛细管电泳 (capillary electrophoresis, CE) 的方法是最初研究最多的。Sanz-Nebot课题组利用腐胺 (1, 4-丁二胺) 动态涂成实现了EPO几种糖基化异构体的基线分离。但这种方法平衡时间长, 重复性差, 且缓冲体系中的非挥发性物质无法与质谱联用[12]。TAICHRIB等[13]利用商品化的毛细管电泳-质谱联用技术结合飞行时间质谱强大的质荷比分辨能力, 检测到更低含量的EPO异构体。采用线性聚酰胺的毛细管中性涂成柱, 实现了唾液酸分离的基础上, 不同Hex Hex NAc二糖单元的有效分离。
  液相色谱 (liquid chromatography, LC) 是一种与CE相当的常见分离手段, 近年来发展非常迅速。HARAZONO等[14]首次报道了利用反向C18固定相结合ESI-MS用于完整EPO蛋白的分析。对质谱数据去卷积处理后, 蛋白相对分子质量范围为28 000~32 000, 糖链的组成为Neu Ac10-14Hexn+3Hex NAcnFuc3 (n=16~26) 。作者还发现了糖链的O-乙酰化修饰、唾液酸二糖Neu Gc-Neu Ac及可能存在蛋白的氧化形式。对去N-糖基化的EPO进行分析, 可鉴定O-糖链的结构为Neu Ac1-2Hex1Hex NAc1及O-糖基化位点。同时, 对Darbepoetin的分析表明, 其糖链的唾液化和乙酰化程度均较高。证明LC/ESI-MS是一种用于评价不同EPO产品糖型相似性的有效手段, 同时得到唾液酸化程度、糖链大小、唾液酸的乙酰化及O-糖基化的信息。与CE相比, 反向色谱对糖蛋白分离效果较差, 然而获得丰富糖链的结构信息, 主要是LC与质谱兼容性更好。
  
  2.2 糖肽的分析
  
  完整EPO蛋白的分析, 具有样品消耗量少、前处理简单 (不需化学或酶解处理) 等优点。然而, 获得的整个蛋白的糖基化信息, 无法确定每个糖基化位点的修饰程度。同时, 完整蛋白质谱分析对仪器性能的要求较高。因此, 可经酶切后, 对分离的糖肽进行分析。理性的状态是每个糖肽中仅有1个糖基化位点, 就可实现位点特异性的糖基化分析。蛋白酶的选择对特异性糖基化分析十分重要, 蛋白组学中常用的是胰蛋白酶 (trypsin) , 可特异性酶切精氨酸 (R) 和赖氨酸 (K) 的C′-末端。在EPO分析中, 由于糖基化位点N24和N38无trypsin酶切位点, 获得的糖肽含有两个糖基化位点, 无法进行位点特异性的糖基化分析。然而, Glu-C特异性酶切谷氨酰胺 (E) 和天冬酰胺 (D) 的C′-末端。Glu-C可有效酶切EPO, 获得的4条糖肽中分别仅含有1个糖基化位点。
  TAKEGAWA等[15]报道了毛细管两性离子亲水相互作用色谱-质谱联用技术对Glu-C酶解后的r Hu EPO的肽段进行分析, 仅需150 ng样品, 单次分析就可鉴定105种N-糖肽和8种O-糖肽。同时, 发现部分N-糖链和O-糖链发生了乙酰化修饰及存在唾液酸形式Neu5Gc。作者还考察N-糖肽的色谱保留机制, 与N-糖链的组成密切相关。
  JIANG等[16]采用Glu-C/trypsin混合酶切, HILIC富集糖肽及结合Orbitrap结构鉴定, 实现了EPO中N-糖肽和O-糖肽的定性和定量分析, 在糖肽的结构鉴定中, 如何通过二级质谱数据识别糖肽母离子十分重要, 研究者通过Y1 (peptide+Glc NAc) 和Y0 (peptide) 离子, 结合常见的糖诊断离子 (单糖、二糖或三糖氧鎓离子及其碎片离子) ;确定糖肽母离子后, 通过高能碰撞解离 (high-energy collisional dissociation, HCD) 碎裂产生的B/Y离子结合GlycoMod计算, 确定糖链的组成;最终鉴定了74条完整的糖肽异构体, 同时结合提取离子流色谱图 (extracted ion chromatograms, XIC) 分析实现糖肽的相对定量分析。
  对于darbepoetin alfa的糖肽分析相对比较复杂, 目前尚无一种酶可酶切Asn24与Asn30及Asn83与Asn88之间的肽键。因此, 传统的特异性酶切手段无法实现darbepoetin alfa位点特异性的糖肽分析。STRUM等[17]和HUA等[18]提出“glyco-AMP”策略, 已成功应用于一系列糖蛋白的位点特异性的N-糖基化和O-糖基化分析, 这种策略利用多个酶切位点的蛋白酶混合物, 通过控制反应时间得到不同程度的酶切产物。因此, “glyco-AMP”策略将有机会用于darbepoetin alfa的糖肽分析。
  
  2.3 糖链的分析
  
  与完整的蛋白或糖肽分析相比, 糖链的分析方法更灵敏。较小的糖链分子更容易分离、质谱离子化或检测也更容易, 可检测到更低丰度的糖型。同时结合串联质谱碎裂或糖苷外切酶酶解的数据, 可实现完整结构的鉴定, 是目前糖基化分析的最重要方法之一[19]。尽管EPO中同时存在N-糖链和O-糖链, 但对EPO糖链的分析主要集中于N-糖链, 这是由于传统用于O-糖链释放的方法如碱性β-消除, 条件比较苛刻, 唾液酸易丢失或O-乙酰化修饰易被破坏[20]。而对N-糖链的分析相对简单, PNGase F酶切就可得到EPO中所有的N-糖链, 再对糖链进行荧光衍生, 常见的衍生试剂2-氨基苯酰胺 (2-AB) 及4-氨基苯甲酸 (4-AA) 已用于EPO糖链的分析[21]。如以MS检测, 衍生不是必须的, 也可直接分析。这样可有效避免衍生过程中产生的化学降解、大量衍生试剂的干扰及额外样品前处理带来的重复性差等问题。
  然而, EPO中的糖链十分复杂, 液相色谱分离在质谱鉴定前是必须的。这不仅可扩大质谱检测的动态范围, 也可减少质谱分析中的离子抑制。目前已有3种类型的色谱形式用于EPO糖链的分离, 包括阴离子交换色谱 (anion exchange chromatography, AEC) 、亲水相互作用色谱 (hydrophilic interaction chromatography, HILIC) 及多孔石墨化碳柱 (porous graphitized carbon column, PGC) 。AEC主要是基于大部分EPO糖链末端唾液酸所带的负电荷实现糖链的分离, 常与HILIC相结合组成二维色谱, 提高其对酸性糖链的分离能力[22-23]。PGC是一种混合模式的固定相, 通过电荷作用、偶极-偶极作用以及疏水作用实现分析物的高效分离, 已被广泛应用于糖链异构体的分离中[24]。
  LLOP等[22]及BONES等[25]首次报道了将HILIC、MALDI-TOF-MS及外切酶测序结合用于对EPO和darbepoetin alfa中N-糖链的分析, 作者通过弱阴离子交换色谱 (weak anion exchange chromatography, WAX) 可获得糖链唾液化的信息。结合与外切酶的特异性及酶切后产物的质谱分子量信息可鉴定HLIC色谱图中每个峰对应糖链的结构, 在此基础上, 作者实现了对二维电泳中每个蛋白点对应糖链结构分析。为进一步评价生物制品的免疫原性, 对其唾液酸类型及乙酰化程度进行了考察, 结果显示, 与r Epoα/β相比, r Epoδ不含Neu5Gc, 不发生O-乙酰化修饰。
  BONES等[25]利用离线二维分离平台AEC x UPLC HILIC, 全面解析EPO中N-糖链的结构, 在此基础上, 通过Lys-C和Glu-C双酶切EPO后结合糖肽纯化, 实现了3个N-糖基化位点特异性的糖型分布研究, 首次在Asn 24和Asn 83鉴定了含有最大数量的聚-N-乙酰乳糖胺二糖重复单元 (poly-N-acetyl lacto samine repeats, Lac NAc) 的糖型。OH等[26]采用纳流色谱-芯片-串联质谱技术 (chip-based nano-LC-MS&MS/MS) 在darbepoetin alfa中鉴定了多达400种N糖链的结构 (包括异构体) , 而该方法对仪器等实验室条件要求较高, 且由于离子化效率的差异等因素可能会导致质谱定量的准确性较低。最近, HASHI等[27]又报道了将LC-MSn的糖链结构鉴定策略与多变量分析数理统计方法相结合, 用于9种r Hu EPO产品糖不均一性的比较, 实验发现基于糖链含量的主成分分析数据是一种有效评价不同r Hu EPO产品的重要参考值。
  
  3 小结与展望
  
  近年来, 许多促红细胞生成类药物的原始专利即将过期, 这类药物的生物仿制药 (biosimilar) 即将进入一个高速发展期。生物仿制药可能会采用一系列不同的培养系统和下游的纯化工艺, 因此药物控制和监管机构已经预测需要更新和开发额外的指导方针和测试用于新产品的审批。促红细胞生成类药物的糖基化修饰在不同的细胞系中不完全一致, 受细胞培养条件及下游工艺影响也较大, 因此, 糖基化修饰的分析并建立质量控制标准是此类药物分析的一个主要研究方向。本文综述了近年来对促红细胞生成素糖基化分析方法的研究进展, 主要从蛋白水平、糖肽水平及糖链水平进行介绍。传统方法比较不同批次的EPO是在完整糖蛋白水平上进行毛细管电泳和等电聚集分析。近年来, 由于高分辨质谱技术的快速发展, 对EPO糖肽和糖链的分析方法日益成熟。因此, 新的糖基化分析方法将成为药典方法的重要补充以及今后药物质量控制和结构与生物活性关系研究的有效手段。
  
  参考文献
  
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