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探讨K562工程细胞对人NK细胞扩增和活化的效果

作者:2015-08-18 10:47文章来源:未知

  人自然杀伤(naturalkiller,NK)细胞依靠自身表面活化性受体与肿瘤细胞表面配体之间的作用,可不受主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex,MCH)限制,识别MHC-Ⅰ类分子不表达或表达下调的肿瘤细胞并对其进行有效地清除和杀伤。NK细胞独特的抗肿瘤免疫功能已受到广泛的重视,并被越来越多地应用到肿瘤的过继免疫治疗当中。由于NK细胞在PBMC中所占比例很少(5%~10%),加上由常规方法分离获得的NK细胞处于非活化状态,因而建立一种有效的体外激活与扩增的方法是开展NK细胞免疫治疗的基础与关键所在。目前常规使用IL-2、IL-15和IL-18等对NK细胞进行体外扩增和激活。课题组前期研究[9]中,将IL-15、4-1BBL和IL-18等在白血病K562细胞上进行跨膜表达制备的K562工程细胞,将此细胞加入培养体系,可使NK细胞扩增约500倍。本研究采用前期建立的高效扩增方法,对来自健康志愿者和肿瘤患者的NK细胞进行扩增,观察扩增活化前后NK细胞的活化性和抑制性受体的表达情况、杀伤肿瘤细胞的细胞毒活性和抗体依赖的细胞介导的细胞毒(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)活性,为进一步完善NK细胞的制备技术和促进其在临床应用奠定基础。

  1材料与方法

  1.1标本来源

  采集福建省漳州市第一医院普通外科、肿瘤科于2012年1月至2012年12月期间收治的10例肿瘤患者,其中男性6例、女性4例,中位年龄59岁(38~70岁),肝癌3例、肺癌3例、卵巢癌2例、直肠癌2例。根据临床分期标准进行分期,10例肿瘤患者的病理分期均为Ⅱ-Ⅲ期。所有患者在采集外周血前均未经放、化疗处理,也未进行任何药物治疗。8例正常对照外周血取自健康志愿献血者,其中男、女各4例,中位年龄38岁(24~49岁)。采集10例肿瘤患者的标本经福建省漳州市第一医院伦理委员会批准,并与患者签署了知情同意书。

  1.2细胞株及主要试剂

  人白血病细胞株K562、肺癌细胞株A549、肝癌细胞株SMMC-7721和乳腺癌细胞株MCF-7均为本实验室保存。流式荧光检测抗体NKG2D、CD94、NKp30、NKp44、NKp46、CD158b、NKB1、NKAT2及抗CD3和CD56的抗体均购自美国BD公司。具有激活NK细胞活性的TKD短肽由美国FDA/CBER实验室合成,ADCC实验所用的靶细胞Vero细胞、WNV病毒和抗WNV单克隆抗体均由美国FDA/CBER实验室提供,NK杀伤靶细胞的活性检测采用日本同仁化学研究所CellCountingKit-8(CCK-8)试剂盒进行检测,淋巴细胞分离液及NK细胞分离试剂盒均购自天津灏洋生物制品科技有限公司(TBD)。

  1.3健康志愿者NK细胞的分离和体外扩增

  扩增前静息NK细胞的获得采用CD-56磁珠分离法,从PBMC中分离NK细胞的方法参照NK细胞分离试剂盒说明书进行操作。NK细胞的体外扩增参照文献[8]的方法进行,即采用淋巴细胞分离液从外周血中分离PBMC,细胞计数后以1∶1的比例加入经辐照灭活的刺激物K562工程细胞(将IL-15、4-1BBL和IL-18等NK细胞活化因子在白血病K562细胞膜上进行跨膜表达,制备具有刺激人NK细胞体外高效扩增功效的“膜蛋白复合物”,简称为K562-GM),用含有200IUIL-2和10%人血浆的1640培养液于37℃培养21d,培养期间换液4次。1

  .4流式细胞术测定

  健康志愿者NK细胞标志物及表面受体采用PE标记的CD56和FITC标记的CD3荧光抗体对经过21d体外培养的NK细胞进行染色,利用流式细胞术对扩增后的NK细胞进行分析,确认NK细胞(CD56+CD3-)的纯度;同时,分别采用PE标记的抗CD94、NKG2D、NKp46、NKp30、NKp44、CD158b、CD158a、NKB1和NKAT2的荧光抗体对NK细胞进行染色,采用流式细胞术检测扩增前后NK细胞表面受体的表达情况,确定扩增的NK细胞__表面受体表达阳性细胞的比例。

  1.5CCK-8法测定健康志愿者NK细胞的肿瘤杀伤活性

  将K562细胞、A549细胞、SMMC-7721细胞和MCF细胞分别接种至96孔板,使细胞数量每孔2×105个,每孔再加入100μl扩增前(磁珠分离)的NK细胞(1×106个)或经过体外扩增培养的NK细胞(1×106个),使效靶比为5∶1。同时设置单独含NK细胞的实验孔和单独含靶细胞的实验孔,37℃下CO2培养箱孵育4h后,每孔加入20μlCCK-8试剂(CCK-8试剂包含WST-8,该试剂可被活细胞内的线粒体脱氢酶还原成有色的甲瓒,通过记录光密度值来反应活细胞的数量)。37℃下CO2培养箱继续孵育2h后,450nm波长测定各孔光密度(D)值,根据以下公式计算NK细胞杀伤率:杀伤率(%)={1-[D(e+t)-De]/Dt}×100%;其中De为单纯效应细胞孔即NK细胞孔的D值;Dt为单纯靶细胞孔即K562细胞孔的D值;De+t为效应细胞加靶细胞孔的D值。

  1.6CCK-8法测定健康人NK细胞的ADCC活性

  将Vero细胞接种于96孔培养板,生长至70%单层时,接种含有100个半数组织培养感染剂量(tissuecultureinfectivedose50,TCID50)的西尼罗河病毒100μl,48h时后加入抗西尼罗河病毒单克隆抗体10μl(含2μgIgG)[11]。随后对照组中每孔加入100μl磁珠分离的NK细胞(1×106个),实验组中每孔加入100μl体外扩增的NK细胞(1×106个),37℃CO2培养箱6h后,每孔再加入20μlCCK-8试剂,继续培养2h,450nm波长测定D值,同上方法计算NK细胞的杀伤率。

  1.7TKD对NK细胞杀伤作用的影响

  将经过21d扩增的NK细胞分为2组,一组培养液中掺入TKD短肽(14肽),使其终浓度为100ng/ml;另一组作为空白对照。作用48h后同1.6中方法计算NK细胞的杀伤率。

  1.8肿瘤患者NK细胞的体外扩增和杀伤活性的检测

  无菌采集10位肿瘤患者外周抗凝血100ml,淋巴细胞分离液分离PBMC,同上方法扩增活化NK细胞并检测NK细胞的纯度及杀伤活性。

  1.9统计学处理

  采用SPSS16.0统计软件分析,数据以珋x±s表示,组间比较使用t检验,以P<0.05或P<0.01表示差异有统计学意义。

  2结果

  2.1新方法对健康志愿者外周血NK细胞体外扩增的效果

  流式细胞术检测结果显示,8例健康自愿者PBMC细胞,经过高效扩增新方法21d培养后,NK细胞(CD56+CD3-)占总细胞的(93±3)%。

  2.2新方法扩增后NK细胞活化性及抑制性受体的变化

  流式细胞术分析结果表明,新方法扩增后NK细胞中活化性受体NKG2D、CD94、NKp30、NKp44和NKp46的阳性率分别提高了60%、40%、20%、40%和63%;抑制性受体CD158b、NKB1和NKAT2阳性率有所降低,但没有统计学意义。

  2.3新方法扩增后提高了NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性NK细胞杀伤活性检测

  结果提示,扩增前健康人NK细胞对肿瘤细胞K562、A549、7721和MCF的杀伤活性分别为(70±15)%、(18±6)%、(35±8)%和(43±12)%,而扩增后NK细胞对这几种肿瘤细胞的杀伤活性分别为(89±6)%、(47±7)%、(61±6)%和(71±8)%,即扩增激活后NK细胞对这4种肿瘤细胞的杀伤活性分别提高了19%、29%、26%和28%。

  2.4新方法扩增后提高了NK细胞的ADCC活性

  采用CCK-8法对8份扩增前后的NK细胞对经WNV感染的Vero细胞进行ADCC杀伤实验,扩增前的NK细胞(由磁珠分离法从PBMC中获得)对感染病毒Vero细胞杀伤活性为(33±5.6)%,新方法扩增后的NK细胞对感染病毒Vero细胞杀伤活性升至(65±12)%,即扩增后NK细胞的ADCC活性提高了32%。

  2.5TKD增强了NK细胞的杀伤活性

  PBMC在体外扩增21d后,再加入TKD进行刺激。结果证明,在扩增过程中添加TKD能进一步刺激NK细胞,其中TKD组的杀伤活性为(95.67±2.52)%,对照组的杀伤活性为(86±4)%。TKD添加组中NK细胞对K562细胞的杀伤活性与对照组相比提高了9.67%。

  2.6肿瘤患者NK细胞扩增和激活的效果

  流式细胞术检测结果显示,10例肿瘤患者的PBMC经扩增后NK细胞比例平均达到(90.02±8.01)%。以其中一位卵巢癌术后患者为例:由100ml外周血中共分离到1×108个PBMC,按照前述方法37℃扩增培养21d后进行细胞计数,细胞总数约为4.3×109个;经流式细胞术分析后测得NK细胞(CD56+CD3-)细胞的比例为93.59%。10例肿瘤患者NK细胞扩增前对K562细胞的杀伤率为(55.37±4.8)%,扩增后NK细胞的杀伤率为(72.05±3.9)%(n=10),扩增后肿瘤患者NK细胞的杀伤活性提高了17%左右。

  3讨论

  过继免疫治疗是指将具有特异免疫力的致敏淋巴细胞(如NK细胞、杀伤性T细胞等)或致敏淋巴细胞的产物(如转移因子和免疫核糖核酸等)输给肿瘤患者,使其获得抗肿瘤免疫力的治疗方法。过继免疫治疗已被美国国家癌症研究委员会确立为继外科手术、放射疗法和化学药物疗法之后的第四种疗法。NK细胞由于其天然且高效的肿瘤杀伤活性受到了广泛的研究和关注,成为过继免疫治疗中除杀伤性T细胞之外非常良好的细胞因子诱导的杀伤(cytokine-inducedkiller,CIK)细胞,目前已被用于如乳腺癌、淋巴癌、直肠癌、结肠癌、肝癌、胃癌、胶质瘤等许多常见肿瘤的过继免疫治疗中。制备高纯度的NK细胞还可用于异体的免疫细胞治疗。然而针对一个患者开展过继免疫治疗并想取得较好的疗效,所需的NK细胞数目至少要达到1×108个,而NK细胞本身在外周血中所占的比例较低,因此难以获得足够数量的NK细胞已成为限制其临床应用的主要瓶颈。

  制备人NK细胞的方法主要有两种:一是采用抗体并通过磁珠分离法,直接从PBMC中分离NK细胞;此法可以快速获得NK细胞,但由于NK细胞在PBMC中的比例很少,所得NK细胞的数目不多,只适用于小规模制备NK细胞及分析性研究。二是体外扩增法,通过一些特殊细胞因子的刺激,使PBMC中的NK细胞在体外得到扩增。IL-15和IL-18因其对NK细胞的发育与增殖的重要调控作用被广泛用于NK细胞的扩增与培养当中。同时研究发现,细胞膜上表达的IL-15比可溶状态下的IL-15刺激NK细胞生长的效果更好,这可能与膜表面表达的IL-15比其可溶状态更容易被NK细胞所捕获,并与NK细胞表面受体结合的效率更高有关。人4-1BB(CD137)分子又被称为淋巴细胞激活诱导的受体(receptorinducedbylymphocyteactivation,RILA),是一种Ⅱ型跨膜蛋白,主要由胞外区、跨膜区和胞质内区三部分所组成。4-1BB分子的配体为4-1BBL,同为Ⅱ型跨膜糖蛋白,主要表达在抗原提呈细胞(antigenpresentingcell,APC)如B细胞、巨噬细胞和树突状细胞(dendriticcell,DC)上。4-1BB和4-1BBL这对共刺激分子的相互作用可提高NK细胞的杀伤活性,在NK细胞介导免疫应答过程中起十分重要的调控作用。TKD是来源于细胞膜热激蛋白70的短肽(aa450-463),并且是HSP70蛋白的表面抗原决定位,其氨基酸顺序为TKDNNLLGRFELSG,具有多种免疫刺激活性。

  综合以上因素,本实验采用基因工程方法,为国内首次将IL-15、IL-18和4-1BBL分子表达于K562细胞表面,构建了能够有效刺激人NK细胞体外增殖与活化的K562工程细胞。然后以K562工程细胞联合IL-2培养人PBMC21d后,能使其中的NK细胞扩增500多倍,NK细胞纯度达90%以上。与其他扩增方法相比较,扩增出的NK数量更大,纯度更高(可溶性细胞因子混合法扩增NK细胞纯度为80%)。同时,扩增获得的NK细胞处于较好的活化状态,针对几种肿瘤细胞(K562、A549、SMMC-7721和MCF-7)均有较好的杀伤活性,且NK细胞的ADCC活性显著增加。扩增后NK细胞活化性受体NKG2D、CD94、NKp46、NKp30和NKp44表达阳性率均有显著增加,而抑制性受体CD158b、NKB1和NKAT2的阳性率变化不大。另外本扩增培养方法对肿瘤患者的NK细胞也有较好的扩增和活化效果,能够显著提高肿瘤患者NK细胞的细胞毒活性,能满足NK细胞临床应用上的需求。总之,本研究建立的NK细胞体外高效扩增方法为深入开发NK细胞的抗肿瘤免疫治疗临床应用提供了重要的实验支持。

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