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谈HPLC 测定马钱子及其提取物中马钱子碱和士的宁含量

作者:2017-02-05 14:54文章来源:未知
  马钱子系马钱科植物马钱Strychnosenux-vomica L.或云南长籽马钱S.wallichiana Steud.ex DC.的成熟种子,有散结消肿、通络止痛之功效,主要用于跌打损伤、痈疽肿痛、风湿顽痹等症。马钱子主要有效成分为马钱子碱和士的宁,并含少量二者的氮氧化物。因其口服毒副反应大,尤其是士的宁,治疗剂量接近中毒剂量,通常以外用为主。因此,有必要对药材及提取物建立含量测定方法,对其质量进行控制,也为进一步以提取物制备透皮给药系统等新型制剂提供保证。本研究通过对多种流动相进行比较,建立马钱子碱和士的宁高效液相色谱法(HPLC)含量测定方法,并检测不同产地3 批马钱子药材与6批马钱子总碱提取物的含量,为其药材及提取物的质量控制提供依据。
  1 仪器与试药
  高效液相色谱仪(四元泵,美国Agilent 1100 Series,二极管阵列检测器),电子分析天平(Xs125A 瑞士普利赛斯仪器公司d=0.000 1 g),RE-5210 旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂),DZF 型真空干燥箱(北京永光明医疗仪器厂)。士的宁对照品(批号110705-200306)、马钱子碱对照品(批号110706-200505),购自中国药品生物制品检定所;马钱子药材(产地广西、缅甸与四川各1 批,分别购自昆明市菊花村中药材市场、西双版纳与四川成都中药材市场),经云南中医学院中药鉴定教研室杨树德教授鉴定为马钱科植物马钱Strychnos nux-vomica L.的干燥成熟种子。乙腈为色谱纯(Merk 公司),庚烷磺酸钠(HPLC 用,Biofer 公司生产,批号26547),水为娃哈哈纯净水,其余试剂为分析纯。AB-8 型大孔吸附树脂(安徽三星树脂科技有限公司)。
  2 方法与结果
  2.1 马钱子总碱提取物的制备
  2.1.1 提取 将马钱子置烘箱中75 ℃干燥12 h,打成粗粉过二号筛,置于烧瓶中,分别加10、8、6 倍量50%乙醇回流提取2、1.5、1 h,过滤。合并3 次滤液,旋转蒸发回收乙醇至无醇味,得50%醇提物备用。
  2.1.2 大孔树脂纯化 将50%醇提物加水至药液浓度为0.4 g/mL,用0.1%NaOH 溶液调节pH 至8~9,经前期试验筛选吸附树脂与洗脱条件,将马钱子提取液上AB-8 型大孔树脂柱,流速1 mL/min,用3 BV 水洗脱杂质、6 BV 的70%乙醇洗脱总碱。合并醇洗脱液,旋转蒸发回收乙醇,真空干燥制成干浸膏。
  2.1.3 硅胶柱分离 将经大孔树脂纯化的干浸膏用适量的甲醇-氯仿(1∶1)混合溶液溶解,加入2 倍量的柱层析硅胶拌样,搅拌均匀,水浴挥干,加入100~200 目硅胶柱中,用乙酸乙酯-异丙醇-浓氨水(7.5∶2.0∶0.4~7.5∶2.4∶0.6)进行梯度洗脱,150 mL/流份。经薄层色谱法检识,合并含马钱子碱和士的宁样品,回收洗脱液,65 ℃真空干燥12 h,研细,即得马钱子总碱提取物。
  2.2 供试品溶液的制备
  2.2.1 马钱子药材 取马钱子药材粉末(过三号筛)约0.6 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加氢氧化钠试液3 mL,混匀,放置30 min,精密加三氯甲烷20 mL,密塞,称定质量,置水浴中回流提取2 h,放冷,再称定质量,用三氯甲烷补足减失的质量,摇匀,分取三氯甲烷提取液,用铺有少量无水硫酸钠的滤纸滤过,弃去初滤液,精密量取续滤液3 mL,置10 mL 量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。
  2.2.2 马钱子总碱提取物 分别精密称取6 个批次的马钱子总碱粉末2 mg,分别置于10 mL 容量瓶中,适量甲醇超声溶解后定容至刻度线,摇匀,即得。
  2.3 对照品溶液的制备
  分别精密称取士的宁对照品6 mg、马钱子碱对照品5 mg,分别置于10 mL 容量瓶中,加三氯甲烷适量使溶解并稀释至刻度,摇匀成母液。分别精密量取2 mL 于同一10 mL 容量瓶中,用甲醇配制成含士的宁0.12 mg/mL、马钱子碱0.10 mg/mL 的对照品溶液。
  2.4 色谱条件与系统适用性试验
  色谱柱:Licrospher C18 柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:乙腈∶0.01 mol/mL 庚烷磺酸钠与0.02 mol/mL 磷酸二氢钾等体积混合溶液(用10%磷酸调pH 值为2.8)=27∶73;柱温:30 ℃;检测波长:260 nm;流速:1 mL/min。在上述条件下,马钱子总碱提取物中的马钱子碱、士的宁达到基线分离,保留时间约6~7 min,理论塔板数按士的宁峰计算应不低于6000,对称因子在0.95~1.05 之间,分离度均大于3,色谱图。
  2.5 方法学考察
  2.5.1 线性关系考察 精密吸取马钱子碱和士的宁混合对照品溶液1、2、4、6、8、10 μL 注入高效液相色谱仪,以进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,并计算回归方程。马钱子碱Y =1491.386X +20.75,r =1.000;士的宁Y =1873X +8.041,r =1.000。结果表明,马钱子碱进样量在0.1~1.0 μg、士的宁进样量在0.12~1.2 μg 范围内线性关系良好。
  2.5.2 精密度试验
  精密吸取混合对照品溶液,连续重复进样6 次,进样体积为10 μL,测定马钱子碱、士的宁色谱峰面积值,并计算RSD 值。结果马钱子碱和士的宁峰面积RSD 分别为1.70%、1.10%,表明精密度良好。
  2.5.3 重复性试验
  取马钱子药材6 份,按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液,精密吸取10 μL,测定其中马钱子碱、士的宁的含量,结果马钱子碱与士的宁的平均含量分别为0.82%、2.02%,RSD 分别为0.91%、0.41%。表明此方法的重复性良好。
  2.5.4 稳定性试验
  取马钱子药材,按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液,精密吸取10 μL,分别于0、2、4、6、8、10、12 h 进样,测得其峰面积,计算含量,结果马钱子碱与士的宁含量的RSD 分别为0.83%、0.38%。表明供试品溶液马钱子碱与士的宁样品在12 h 内稳定性良好。
  2.5.5 加样回收率试验
  精密称取马钱子药材约0.6 g,按“2.2.1”项下方法操作,制备高、中、低3 个浓度的供试品溶液,测定其峰面积,计算马钱子碱与士的宁的含量见表1。分别精密称取马钱子碱和士的宁对照品3.5、7.5 mg,制备成高、中、低3 个浓度对照品溶液,加入近似等量的3 个浓度样品溶液中,测定混合溶液中马钱子碱和士的宁的含量,计算加样回收率。
  2.6 样品含量测定
  2.6.1 马钱子药材
  按“2.2.1”项下方法与“2.4”项下色谱条件,分别精密吸取对照品溶液和3 个产地药材供试品溶液各10 μL,注入液相色谱仪,测定,即得。
  2.6.2 马钱子总碱提取物
  按“2.2.2”项下方法与“2.4”项下色谱条件,测定广西产马钱子总碱提取物含量。马钱子总碱提取物含量测定结果(%)批号 马钱子碱士的宁 总碱含量平均含量20110926 28.59 63.66 92.2520111006 30.80 59.84 90.6420111007 30.68 59.87 90.5520111010 31.28 60.84 92.1291.4720111013 32.03 57.63 89.6620111015 33.65 59.96 93.613 讨论3.1 流动相的选择笔者参考文献报道的多种流动相:①乙腈-0.01 mol/L 庚烷磺酸钠与0.02 mol/L 磷酸二氢钾等量混合溶液(用10%磷酸调pH 值为2.8,21∶79)、②乙腈-水(每l000 mL 中含磷酸二氢钾3.4 g、十二烷基硫酸钠1.7 g,60∶40)、③A(75%)甲醇-B(25%)水-乙酸-三乙胺(230∶2.4∶0.3)、④乙腈-0.3%三乙胺(磷酸调pH 至2.8,12∶88)。结果后3 种流动相峰形较差,拖尾严重,分离效果不佳,且保留时间长,分析效率低。而流动相①的峰形和分离度较好,但需价格较贵的庚烷磺酸钠,且出峰时间在13~15 min,经对流动相比例进行调整,结果将两相比例由21∶79 调至27∶73 时,士的宁和马钱子碱色谱峰与其他峰均达到基线分离,分离度良好,保留时间在6~7 min,提高了分析效率,减少了庚烷磺酸钠的用量。
  3.2 药材产地选择
  通过收集到的3 个产地马钱子药材含量测定的结果可见,药材产地不同,马钱子总碱含量差异较大,因此对提取前药材的质量控制尤其重要。本研究综合药材含量地价格方面考虑,选择以广西产地药材作为提取物原料。
  3.3 马钱子提取物的应用
  马钱子提取物主要用于制备透皮给药系统,因透皮贴剂载药量有限,因此进行了大孔树脂-硅胶柱纯化,以提高马钱子总碱的纯度。将马钱子总碱制成贴剂有利于精确控制给药速率,降低毒性,提高马钱子用于治疗风湿性关节炎、偏瘫等的疗效。
  3.4 供试品溶液制备方法
  马钱子药材供试品溶液制备系按照2010 年版《中华人民共和国药典》中马钱子含量测定项下方法,马钱子总碱供试品因采用甲醇超声即能完全溶解,快速方便,故选用该法。
 

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