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谈半夏泻心汤抗大鼠应激性胃黏膜损伤及对炎性相关因子含量的影响

作者:2017-01-23 14:04文章来源:未知
  随着现代生活应激源的增加和持续存在,应激性胃黏膜病变的发生日益增多。应激性胃黏膜病变是机体在遭受应激状态时,发生的一种以炎性糜烂、浅表性溃疡及胃肠道出血为特征的急性胃黏膜损伤病变。胃是对应激反应最为敏感的器官之一,所以在身体和心理应激状态下很容易导致胃黏膜的急性损伤。中医认为心理应激属于中医的情志致病范畴,引发脏腑气机失调是其致病的重要特点,在应激性胃黏膜损伤病变中病位在脾胃,脾胃气机失调是其病机,所以防治的关键是调理中焦脾胃气机,使气机升降之枢纽协调通畅,中医以辛开苦降法作为调理气机重要治法,而斡旋脾胃气机的代表方就是半夏泻心汤,临床和研究均证实辛开苦降的代表方半夏泻心汤可有效地预防应激性溃疡的发生。胃黏膜的急性损伤主要是由于胃黏膜的保护因子和攻击因子失去平衡有关,其中炎性相关因子的含量改变在病变中发挥重要作用。
  1 材料与方法
  1. 1 动物分组
  与处理健康Sprague - Dawley 大鼠40 只,雄性,体质量180 ~ 220 g,购自湖南斯莱克景达生物有限责任公司,动物合格证号: SCXK( 湘) 2011 - 0003。40 只大鼠按随机数字表法随机分为4 组: 空白组、模型组、中药组,西药组,每组10 只。实验程序经湖南中医药大学试验动物中心动物伦理委员会批准。4 组动物于实验前饲养于湖南中医药大学动物实验中心,适应性饲养1 周,控制室温( 25 ±2) ℃,相对湿度( 65 ± 5) %,饲养条件相同。适应性饲养1周后,中药组给予半夏泻心汤药液按照1 mL/100 g 灌胃,1次/d,持续3 d; 西药组给予奥美拉唑1 mL/100 g 灌胃; 空白组和模型组以等量生理盐水灌胃处理。
  1. 2 实验药物
  半夏泻心汤所用中药( 半夏、黄芩、黄连、干姜、人参、炙甘草、大枣) 均一次性购自湖南楚仁堂大药房,经湖南中医药大学中药教研室专家鉴定,为正品。药物剂量比例按《伤寒论》原著:“半夏半升,黄芩、黄连、人参、炙甘草各3 两,黄连1 两,大枣12 枚”。根据文献换算为现代用量,半夏55. 7 g,黄芩46. 875 g,干姜46. 875 g,人参46. 875 g,炙甘草46. 875 g,黄连15. 625 g,大枣42 g。依据人单位体质量生药量( 60 kg) 换算得大鼠单位体质量( 200 g) 生药量。药物水煎30 min,2 次,提取水煎液,合并,水浴加热蒸浓缩至所需量,贮于冰箱中备用。奥美拉唑,北京康蒂尼药业有限公司生产,规格: 20 mg /片,批准文号: 国药准字H20031216,购于湖南老百姓大药房。实验时依人用药量换算成大鼠用药量,根据灌胃量,以生理盐水稀释成所需浓度。
  1. 3 主要试剂和仪器
  IL - 1β、IL - 8、TNF - α、IL - 10 酶联免疫( ElISA) 试剂盒( 武汉博士德生物工程有限公司) ;PW - 812 多功能全自动酶标洗板机( 深圳汇松科技有限公司) ; MB - 530 酶标仪( 深圳汇松科技有限公司) TGL 16M台式高速冷冻离心机; ( 长沙科威实业有限公司) ; ES -C600 电子天平( 长沙湘仪天平仪器厂) ; DK - 8D 型电热恒温水槽( 上海精宏实验设备有限公司) ; DHG - 9246A 型电热恒温鼓风干燥箱( 上海精宏实验设备有限公司) 。
  1. 4 造模方法
  除空白组外,中药组、西药组、模型组大鼠采用WRS制作急性胃溃疡模型。大鼠禁食不禁水24 h,将大鼠仰卧捆绑固定于鼠板上,然后将鼠板直立于( 20 ±1) ℃的水箱中,水面平大鼠胸骨剑突水平,水浸10 h 后大鼠取出松绑。
  1. 5 胃黏膜损伤指数
  ( UI) 检测造模后,所有大鼠10%水合氯醛麻醉仰卧固定于鼠板上,剖腹腹腔静脉采血,取胃。沿胃大弯剖开,用生理盐水冲洗干净,再用毛笔轻轻刷去胃黏膜表面黏液,在滤纸上平展开,10 倍放大镜下肉眼观察大鼠的胃黏膜损伤情况,按: 斑点糜烂计≤1 mm 计1 分; 1 mm < 损伤长度≤2 mm 计2 分; 2 mm < 损伤长度≤3mm 计3 分; 3 mm < 损伤长度≤4 mm 计4 分; 糜烂长度> 4mm 计5 分; 宽度≥2mm 者计分加倍,累计所得损伤指数。
  1. 6 ELISA 法检测
  IL - 1β、IL - 8、IL - 10、TNF - α 含量所有动物于造模后, 10%水合氯醛腹腔注射麻醉。剖腹后,用一次性负压采血针腹动脉采血5 mL 静置30 min,- 4 ℃低温3000 r /min 离心15 min,取上清液置于- 20 ℃保存,测血清中IL - 1β、IL - 8、IL - 10 的含量。所有动物摘下全胃,沿胃大弯剖开,用生理盐水冲洗,取一部分胃组织称重,按1. 5 mL/400 mg 比例加入生理盐水,用玻璃匀浆器研磨,制成胃黏膜组织匀浆,4℃3000 r /min 离心10 min,取上清液,- 20 ℃低温保存,测胃黏膜中TNF - α 含量。从冰箱取出试剂盒和样品在室温平衡20 min; 取出板条,设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL; 待测样本孔先加生物素10 μL,再加待测样本50 μL; 随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶( HRP) 标记的检测抗体100 μL,用封板膜封住反应孔, 37 ℃水浴锅或恒温箱温育60 min; 弃去液体,在吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1 min,甩去洗涤液,在吸水纸上拍干,如此重复洗板5 次( 也可用全自动酶标洗板机洗板) 。每孔加入底物A、B 各50μL, 37 ℃避光孵育15 min。每孔加入终止液50 μL, 15 min内,在450 nm 波长处测定各孔的OD 值; 在Excel 表中,以标准品浓度作为横坐标,以对应OD 值作为纵坐标,绘制标准品线性回归曲线,按曲线方程计算出各样本的浓度值。
  1. 7 统计学方法
  采用SPSS 16. 0 软件进行分析,计量资料数据用均数± 标准差( 珋x ± s) 表示。正态性检验,若符合正态分布者,多组比较采用单因素方差分析( One - wayANOVA) ,方差齐者用LSD 和SNK 法,若方差不齐者用Tamhane’s T2 或Dunnett’s T3 法; P < 0. 05 认为所检验的差异具有统计学意义。
  2 实验结果
  2. 1 各组光镜观察结果空白组大鼠胃黏膜上皮结构完整,细胞排列整齐有序,胞核胞质清晰,黏膜下层和肌层层次清楚连续,未见炎性细胞浸润( 见插页ⅩⅣ) ; 模型组大鼠胃黏膜全层结构破坏,细胞排列无序,胃腺细胞大量坏死,胞核胞质模糊,细胞内可见充血水肿,毛细血管增生及出血,扩张的血管里可见大量的胞浆红染,黏膜下可见以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润的急性炎症反应,胃黏膜损伤明显( 见插页ⅩⅣ) ; 中药组胃黏膜表面有部分脱落,细胞内充血情况明显改善,炎症细胞浸润较少( 见插页ⅩⅣ) ; 西药组胃黏膜基本完整,黏膜上皮细胞较整齐,腺体排列规则,有少量炎性细胞浸润( 见插页ⅩⅣ) 。
  2. 2 各组UI 结果比较模型组大鼠胃黏膜损伤指数最高,与空白组比较,具有显著差异,P <0. 01,说明造模成功; 与模型组比较,中药组和西药组胃黏膜损伤指数均降低,差异具有统计学意义,P <0. 01; 与中药组比较,西药组的胃黏膜损伤指数略有升高,但差异无统计学意义,P > 0. 05,说明中药和西药均可降低胃黏膜损伤指数,疗效无显著差异。
  3 讨论
  本实验以水浸和束缚双重应激制备应激性胃黏膜损伤模型,是目前常用的应激性溃疡研究模型。本造模方法以“水浸束缚不良刺激”的因定证,制备了“气机紊乱证”和“应激性溃疡”病证结合的动物模型。中医半夏泻心汤被认为是治疗胃肠疾病的首选方和基础方,特别是保护胃黏膜疗效显著,并且现代研究证实此方具有抗抑郁作用,可以调畅气机,而脾胃为枢纽,全方辛开苦降、寒热并用、补泻同施,以恢复脾胃的气机升降。
  各种胃溃疡,包括应激性溃疡,重要病理学特征就是胃黏膜组织存在大量炎性细胞浸润及明显的炎症反应。炎性细胞主要通过产生促炎性细胞因子和氧自由基等多种炎性介质,产生瀑布级联效应,在应激性溃疡急性胃黏膜损伤的发生和发展中发挥了关键作用。炎性因子中促炎细胞因子与抗炎细胞因子构成的一个复杂的反馈网络系统,在这个网络系统中肿瘤坏死因子和白介素在胃肠道黏膜炎症损伤中起着关键性作用,贯穿于整个受损过程,是溃疡发作的主要原因。
  IL - 1 是炎症反应中最早产生的细胞因子,包括IL -1α 和IL - 1β。IL - 1β 可促进其他炎性细胞因子表达,协同作用,促进中性粒细胞浸润。TNF - α 是一种多功能细胞因子,具有诱导趋化性细胞因子IL - 8、上调血管内皮细胞黏附分子的表达,诱导内皮细胞产生血小板活化因子等功能,可通过持续分泌氧自由基、一氧化氮等诱导中性粒细胞、单核巨噬细胞等释放脂质介质、溶酶体、前列腺素等炎性介质,引起或加重炎性反应。Isobe H等证明在水浸束缚应激模型中,血浆TNF - α 水平于应激1 h 后明显升高,而且与胃黏膜损伤有明显的相关性。临床通过研究不同病因导致的应激性胃黏膜损伤改变,及其血液中ET、TNF - α 的浓度变化,证实在不同病因所致的应激性胃黏膜损伤时,血液中ET、TNF - α 浓度增加,表明ET、TNF - α 对应激性胃黏膜的损伤有重要作用。IL - 10 是一种免疫抑制因子,可抑制单核- 巨噬细胞、嗜酸细胞、中性粒细胞产生促炎性细胞因子如TNF - α、IL - 1α、IL - 1β、IL- 6 等,因此被作为具有抗炎作用的细胞因子。IL -8 是一种趋化性细胞因子,可以促进炎性细胞的趋化,主要生物学作用是趋化并激活中性粒细胞,促进中性粒细胞的溶酶体酶活性和吞噬作用,对嗜碱性粒细胞和T 细胞也有一定的趋化作用。中性粒细胞与IL - 8 接触后发生形态变化,定向游走到反应部位,释放一系列活性产物,这些作用可导致机体局部的炎症反应,从而达到杀菌和损伤细胞的目的。
  本实验结果显示水浸束缚应激,可使大鼠促炎因子IL- 1β、TNF - α、IL - 8 的含量显著增加,抑炎因子IL - 10 的含量显著降低,从而引发胃黏膜炎症反应,导致急性胃黏膜损伤。半夏泻心汤的辛开苦降、寒热并用法可抑制大鼠胃黏膜损伤、减轻胃黏膜的急性炎症反应,其作用机制可能是通过抑制促炎因子IL - 1β、TNF - α、IL - 8 和促进抗炎因子IL - 10 而达到其抗胃黏膜损伤作用。
 

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