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谈HPLC 法测定骨痹舒片中士的宁和马钱子碱的含量

作者:2017-01-23 14:03文章来源:未知
  骨痹舒片为河南风湿病医院院内制剂,由制马钱子、制何首乌、桑寄生、黄芪等中药组成。具有补肾壮骨蠲痹、活血通络的功效,用于治疗强直性脊柱炎、类风湿关节炎、骨关节炎等顽痹。方中制马钱子的主要有效成分是士的宁和马钱子碱等生物碱类,同时它们也是毒性成分,均对神经系统、免疫系统及肾脏有毒性作用。二者的治疗剂量和中毒剂量接近。中国药典规定制马钱子治疗剂量为0.3 ~ 0.6 g(相当于含士的宁2.3 ~ 4.9 mg,马钱子碱1.5 ~ 3.0 mg),士的宁口服中毒剂量成人为5 ~ 10 mg,口服致死量为30 mg。为保证临床用药安全有效,有必要对骨痹舒片中士的宁和马钱子碱的含量进行有效控制。因此,本实验研究HPLC 法测定士的宁和马钱子碱的含量,并以其为指标控制本品的质量。
  1 仪器与药物
  Waters 2695 高效液相色谱仪,Waters2489型紫外检测器; 士的宁对照品( 批号110703-200306)、马钱子碱对照品(110706-200505),均购自中国药品生物制品检定所;甲醇为色谱纯;水为超纯水;其他试剂均为分析纯。骨痹舒片。
  2 方法与结果
  2.1 色谱条件与系统适用性试验
  色谱柱AgilentC18 色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为甲醇250 g·L-1∶缓冲液(水∶乙酸∶三乙胺= 230∶2.4∶0.3)750 g·L-1;体积流速1.0 mL·min-1;检测波长254 nm;柱温25 ℃;进样量10 μL。理论板数按士的宁峰计算应不低于5 000。
  2.2 溶液的制备
  2.2.1 对照品溶液的制备
  精密称取士的宁对照品、马钱子碱对照品适量,分别用甲醇定容于10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,作为对照品储备液;分别精密量取士的宁对照品溶液1 mL、马钱子碱对照品溶液0.5 mL,置5 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得每1 mL 含士的宁0.128 mg、马钱子碱0.094 8 mg 的混合对照品溶液。
  2.2.2 供试品溶液的制备
  取骨痹舒20 片,除去薄膜衣,研细,取约1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中;精密加入浓氨试液1 mL,氯仿25 mL,密塞,称定重量,超声处理(功率80 W,频率35 kHz)60 min,放冷,再称定重量;用氯仿补足减失重量,精密量取续滤液10 mL 置蒸发皿中,水浴蒸干, 加甲醇溶解并定容于10 mL 量瓶中,摇匀,微孔滤膜(0.22 μm)滤过,取续滤液,即得。
  2.3 空白对照溶液的制备
  按处方制备不含制马钱子药材的阴性样品,按2.2.2 项方法制成相应的空白对照溶液。
  2.4 方法学考察
  2.4.1 专属性考察试验
  取对照品溶液、不含制马钱子空白对照溶液及供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,分别记录色谱图。结果表明阴性溶液无干扰,该方法专属性较好。
  2.4.2 线性关系考察
  精密吸取士的宁和马钱子碱混标对照品溶液1,2,4,6,8,10,12 μL,注入液相色谱仪,测定,以士的宁和马钱子碱的进样体量(μL)为横坐标(X),色谱峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线,结果在此范围内均呈良好的线性关系,得士的宁回归方程Y=209 093X - 635 98,r2 =0.999 9,马钱子碱回归方程Y=113 658 X- 339 50,r2 =1。表明士的宁在0.120 8 ~ 1.449 6 μg、马钱子碱在0.094 8 ~ 1.137 6 μg 呈良好的线性关系。
  2.4.3 精密度试验
  精密量取供试品溶液10 μL,重复注入液相色谱仪6 次,测定,计算得士的宁与马钱子碱峰面积的RSD 分别为0.33%,0.74%,表明仪器精密度良好。
  2.4.4 稳定性试验
  取同一批号供试品溶液分别0,2,4,6,8,12 h,精密量取10 μL,注入液相色谱仪,测定,记录峰面积。计算得士的宁与马钱子碱的RSD 值,分别为1.04%,0.88%。表明样品溶液在12 h 内稳定。
  2.4.5 重复性试验
  取同一批号骨痹舒片6 份,精密称定,按 2.3 项方法制备供试品溶液,按样品含量测定方法测定,结果测得士的宁平均含量为0.72 mg·g-1,RSD 值为1.36%;马钱子碱平均含量为0.53 mg·g-1,RSD 值为2.43%。
  2.4.6 加样回收率试验
  取已知含量的同一批号供试品1 g,精密称定6 份,分别加入适量的对照品,按照2.3 项下方法制备供试品溶液,精密量取10 μL,注入液相色谱仪,测定。士的宁的平均回收率分别为99.01%,RSD 值为0.91%;马钱子碱的平均回收率97.37%,RSD 值为1.26%。结果见表1、表2。2.5 样品含量测定 取3 个批次骨痹舒片样品,按2.2.2 项下方法操作,精密量取10 μL,注入液相色谱仪,测定。以外标法计算士的宁和马钱子碱含量。
  3 讨 论
  实验比较了加热回流提取2 h、浸渍法和超声提取法3 种提取方法提取士的宁和马钱子碱的效果, 结果三者差异无统计学意义(P > 0.05)。故选择采用操作简单快速的超声提取法。实验中还对超声提取时间分别考察30,60,90,120 min,实验结果表明,供试品用三氯甲烷为溶剂,提取时间为60 min,提取效果较好。
  在样品提取过程中,须将样品用适量的浓氨试液润湿,然后再加入氯仿提取。加入浓氨试液后,样品细粉易于粘挂在提取容器壁上,故提取时应缓慢加入提取溶剂;并避免振摇,以免影响测定结果的准确性。马钱子及其制剂中士的宁、马钱子碱含量测定的HPLC 方法已有很多报道,多数在流动相中加入庚烷磺酸钠和磷酸缓冲盐,使色谱洗脱步骤繁琐。本实验采用在流动相中加入乙酸和三乙胺,既降低了分析成本,简化了分析步骤,又能实现士的宁、马钱子碱的有效分离。本测定方法灵敏度高,专属性强,重复性好,且空白对照无干扰,能准确有效地测定骨痹舒片中士的宁和马钱子碱的含量。
 

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