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清脂护肝方对大鼠非酒精性脂肪性肝炎的作用讨论

作者:2016-12-29 16:03文章来源:未知
  非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是指肝细胞脂肪变性、小叶和(或)汇管区炎性反应,有时伴有Mallory小体形成和肝纤维化的一种病理状态。有关NASH 的发病机制迄今为止尚未阐明,近年来的研究更倾向于“多重打击论”的学说。中医认为,NASH 乃湿、痰、瘀互阻而发病,根据其发病的机制,遵循中医学辩证施治的原则,清脂护肝方用于治疗NASH 疗效显著。
  Src家族由Lyn 相关激酶(Lyn、Hck、Lck 和Blk)、Src相关激酶(Src、Yes、Fyn和Fgr)和3种Src家族激酶相关的激酶(Brk、Frk和Srm)等共11个成员组成。它们构型相似,有相同的功能域,共同参与细胞的转化以及细胞内信号转导的过程,参与机体多种重要的生理功能。相关文献表明:Src家族相关激酶中Hck、Lyn、Fgr主要存在于单核巨噬细胞等炎性细胞中,并与库普弗细胞的激活关系密切;Src抑制的蛋白激酶c的底物(SSeCKS)是一种细胞骨架蛋白,调节蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C (PKC)信号通路,在肝纤维化模型肝星状细胞及肝脏炎症组织中的库普弗细胞中有一定的表达。
  本课题组在前期研究中发现:在LPS诱导的急性肝损伤中,SSeCKS表达上调,并与LPS呈量依赖关系(5 mg/kg表达最高),说明SSeCKS与肝脏的炎性反应有关。腹腔注射CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型发现,在活化的肝星状细胞中,SSeCKS 表达明显增加;体外实验证实SSeCKS参与星状细胞的活化、肝纤维化的发生发展。同时发现,Hck,Lyn在库普弗细胞中有表达。本研究初步分析清脂护肝方可能会影响NASH 的相关指标,包括肝功能、血脂、SSeCKS分子和Hck、Fgr、Lyn的表达,探讨其对NASH的影响及其机制。
  材料和方法
  一、实验动物及细胞
  2月龄58只雄性SD大鼠(南通大学医学院动物实验中心提供,体质量180~240 g)除对照组12只,其余均喂养高脂饲料(80.5%普通饲料、2%胆固醇、12%猪油、5%蛋黄粉、0.5%胆酸钠)制备NASH 模型,8周后随机抽取6只模型大鼠和2只正常大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉,取下肝脏做病理切片,验证造模是否成功。将余下的40只造模成功的大鼠按体质量随机分成模型组、清脂护肝方低剂量组、中剂量组和高剂量组,每组10只;模型组和对照组均予以0.9%NaCl溶液灌胃,清脂护肝方组分别以2.43 g·kg-1·d-1,12.15 g·kg-1·d-1,24.3 g·kg-1·d-1灌胃6周,给药期间均喂以正常饲料。实验库普弗细胞是RAW264.7小鼠的细胞株,由上海仁济医院消化病研究所马雄教授所赠与。
  二、取材及标本检测
  取正常对照组、模型组及清脂护肝方低剂量组、中剂量组、高剂量组肝组织用10%中性甲醛溶液固定,石蜡包埋切片,IHC法检测肝组织中Hck、Lyn、Fgr、SSeCKS的表达。
  三、检测方法
  1.肝功能及血脂:采用日本OLYMPUS全自动生化分析仪及配套试剂检测。
  2.IHC法检测NASH 大鼠肝组织中SSeCKS、Hck、Lyn、Fgr的表达水平:造模成功后取肝脏组织用中性甲醛溶液固定,处理,包埋,切片,脱蜡,组织片烤干后,脱色水化,热修复(Tris-EDTA 缓冲液pH9.0抗原修复液购买于上海基因科技公司),加一抗(Lyn抗体,1∶400,ab40660,ABCAM 公司;SSeCKS抗体,1∶2000,ab49849,ABCAM 公司;Hck抗体,1∶600,sc-72,SANTA 公司;Fgr抗体,1∶600,H00002268-M01,NOVUS公司)于4℃下过夜,次日加二抗(中国福州迈新生物技术开发有限公司),1 h后用冲片,加DAB显色剂(中国福州迈新生物技术开发有限公司),在显微镜下观察显色情况,显色后用蒸馏水终止染色,将显色后的组织片放入苏木素中复染1 min,自来水清洗5 min。将组织片依次放入100%乙醇,二甲苯1,二甲苯2中脱水,封片,显微镜下观察及摄片。
  3.ICC法检测库普弗细胞中SSeCKS、Hck、Lyn、Fgr的表达水平:对库普弗细胞株采用不同浓度不同时间的CCl4刺激,用含20%清脂护肝方药物血清培养后刺激固定爬片细胞,用蒸馏水洗涤细胞爬片5 min×1次,PBS浸泡5 min;滴加3%H2O2去离子水,室温孵育30 min。PBS洗5 min×3次;滴加0.3%Triton X-100(全液用蒸馏水稀释)通透30 min;PBS洗5 min×3次;滴加一抗(Lyn 1∶600,Hck 1∶600,SSeCKS 1∶2000,Fgr 1∶800),4℃ 过夜。PBS洗5 min×3次;滴加二抗,室温1 h。PBS洗5 min×3次;DAB显色液按A:(A+B)=1∶50配制,混匀,镜下显色观察。蒸馏水终止;苏木素染75 s。自来水充分冲洗;依次在75%乙醇→85%乙醇→95%乙醇→100%乙醇→二甲苯中浸泡2 min脱水;封片,显微镜下观察及摄片留图。
  四、统计学分析
  应用SPSS19.0软件进行数据分析。计量资料如呈正态分布或近似正态分布,以珔x±s表示,两组均数比较用t检验,多组均数比较用方差分析;P<0.05表示差异有统计学意义。
  结  果
  一、大鼠一般情况
  模型组大鼠造模后出现急躁易激怒,活动减少,腹部膨隆,精神不振,饮食量减少,尿色黄,便稀味臭,体重增加。正常对照组大鼠一般状态良好,反应灵敏,体重增加,饮食及二便正常。治疗组从治疗给药起,状态好转,大便逐渐正常,整体观察介于模型组与正常组间。
  二、清脂护肝方对NASH大鼠肝功能及血脂的影响
  1.肝功能:模型组大鼠ALT、AST、TBil均较正常对照组升高(P<0.05)。清脂护肝方各剂量治疗组ALT与模型组比较明显降低(P<0.01),大剂量治疗组AST与模型组比较明显降低(P<0.01),各组Alb水平无明显差异。中、大剂量组的血清TBil较模型组清脂护肝方较模型组显著下降(P<0.01),但小剂量组较模型组无明显差异(P>0.05)。
  2.血脂:与正常对照组比较,模型组TG、CH、LDL均明显上升(P<0.01),HDL 有所降低(P<0.05)与模型组比较,清脂护肝方组的TG、LDL有所降低(P<0.05),尤其大剂量组降低相对更明显,各治疗组间HDL无明显差异(P>0.05);清脂护肝方各剂量组CH 均有所降低。
  三、ICC法检测SSeCKS、Hck、Lyn、Fgr的表达
  Lyn、Hck在库普弗细胞中有表达,并与炎症程度呈正相关,清脂护肝方药物血清培养后表达减少,Fgr和SSeCKS在库普弗细胞中无明显表达。详见图1~图4。__四、IHC法检测NASH 大鼠肝组织中SSeCKS、Hck、Lyn、Fgr的表达模型组SSeCKS蛋白在肝组织中的表达显著低于正常组,在治疗组中的表达介于模型组和正常组之间,但差异无统计学意义(r=8.004,P=0.601);模型组的Hck、Lyn蛋白在NASH 大鼠肝组织中的表达显著高于正常组,在治疗组中的表达介于模型组和正常组,其中大剂量组差异有统计学意义(P<0.05),中小剂量与模型组间差异无统计学意义(P>0.05);Fgr各组均为阴性表达,组间差异无统计学意义。
  讨  论
  清脂护肝方主要由9种中药组成,其中黄连、党参、黄芪和仙灵脾共为君药,有清胃热、健脾益气、温肾以助脾运化痰之功;红花、赤芍、川芎共为臣药,有活血化瘀、行气疏肝之功;枸杞子、生山楂为佐使药,有调补肝肾、消食滞之效。实验发现:与正常对照组相比,模型组大鼠体质量明显增加,与模型组相比,中大剂量组体质量均有减轻,其中大剂量组的体质量减轻最为明显,说明清脂护肝方有减轻体质量的作用,可能与清脂护肝方中的山楂等有健脾消食的作用相关。
  ALT是反映肝功能的可靠指标,NASH 时因肝实质细胞的脂肪变性及炎性反应,肝功能受到损害,ALT升高,但若病变严重进展到重症肝坏死,肝细胞不能产生转氨酶,出现胆红素明显升高而ALT可仅轻度升高,这种“胆酶分离”常提示疗效不良。但是ALT水平与肝脏病理改变没有明确相关性。与正常组相比,模型组中ALT明显升高,说明高脂饮食确实会损伤肝功能情况,清脂护肝方治疗后ALT水平均有明显下降。AST除在心肌及骨骼肌中表达外,在肝细胞中的线粒体中也有表达,因此AST也是反映肝功能的一项重要指标。实验结果示模型组比正常组的AST 水平明显升高,而不同剂量治疗组在降低AST方面起了重要作用。Alb、TBil也是反映肝功能的重要指标,TBil在治疗后也有明显差异,主要体现在中大剂量组,而小剂量组并无明显差异,Alb在正常组及模型组、模型组与治疗组之间没有明显差异,且均在正常范围内,说明高脂处方未能改变大鼠的Alb指标,考虑原因为造模时间的影响。本研究还发现,模型组血清CH、TG、LDL水平较正常组升高(P<0.05),HDL较正常组降低(P<0.05),治疗组CH、TG水平明显降低(P<0.05),而HDL水平有提高的趋势(P>0.05),在降低CH、TG、LDL指标方面治疗组有良好效果,大剂量组相对更好。但治疗前后未能增加HDL的表达,结合目前关于LDL、HDL尚未有明确参考标准,无法判断实验前后大鼠内LDL、HDL水平是否到达病理水平,所以亦无法评估清脂护肝方对此两个指标的影响。
  对Src家族的检测发现:Hck、Lyn在正常肝脏组织中低表达,模型组中高表达,用药组无论是大、中、小剂量组,抑制Lyn、Hck表达有显著效果,特别是大剂量组;推测清脂护肝方可能通过Lyn、Hck信号通路下调炎性因子的表达水平,从而发挥抗炎作用,且该作用与药物剂量有关。模型组的SSeCKS蛋白表达显著低于正常组,在治疗组中的表达介于模型组和正常组,同时伴随Lyn、Hck表达的升高呈减少趋势,提示SSeCKS与Src家族相关激酶(Lyn、Hck)存在某种上下游抑制关系;表明清脂护肝方能提高SSeCKS的表达,从而减轻炎性反应,且以大剂量组效果最好;而清脂护肝方对Fgr的表达无明显影响。综上所述,清脂护肝方能减轻肝脏的炎性反应,明显改善肝功能和血脂,其机制可能与SSeCKS、Lyn、Hck信号通路有关,且高剂量时疗效更优。
 

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