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WD40编码的P53 RNA反义转录子基因和蛋白的功能研究

作者:2016-08-18 13:51文章来源:未知
  WD40编码的P53 RNA反义转录子(WD40-encoding RNA antisense to P53,WRAP53)与P53mRNA相互作用可维护内源性P53 mRNA水平的稳定,进一步诱导P53的表达,从而发挥P53的肿瘤抑制功能,参与细胞周期阻滞、衰老、程序性死亡、自噬和新陈代谢等生化过程。WRAP53蛋白[也称端粒酶卡侯体(Cajal body,CB)蛋白1(telomerase Cajal body protein1,TCAB1)或WDR79]是一种端粒酶核心蛋白,为端粒酶全酶里的一个新的亚单位。端粒酶全酶在维持端粒长度过程中发挥着重要的作用。健康的体细胞随着细胞增殖,其端粒长度逐渐缩短。随着细胞分裂次数的增加,DNA每复制1次,端粒就丢失20~50 bp,当端粒缩短到一定程度时,就失去了保护染色体末端的功能。
  1 WRAP53基因及其功能
  1.1 WRAP53基因
  WRAP53经基因命名委员会通过并认可,为官方名称。WRAP53基因号为55 135,位于染色体17p13,全长1 837 bp,其开放阅读框1 647 bp。该基因有1α、1β和1γ三个起始外显子,其中1α与P53的第一外显子有高达227 bp反向互补,可转录形成P53的一种天然内源性反义转录子WRAP53。WRAP53和P53重叠区域高度保守,几乎91%的序列在人和老鼠间相同。1β位于1α的下游,可转录翻译出WRAP53蛋白。该蛋白质属于WD40家族,涉及细胞程序性死亡、周期调控以及蛋白酶降解和RNA代谢等多个重要生化过程。WRAP53蛋白包含548个氨基,其相对分子质量在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳泳道上为7.5×104,在人类肿瘤细胞中普遍存在。1γ与P53的第一个内含子反向互补。
  1.2 WRAP53基因的功能
  P53是一种肿瘤抑制基因,可应对癌基因的激活和其他应激反应时触发细胞周期阻滞和程序性死亡等。在正常情况下,P53起着预防人类癌症的关键性作用。在肿瘤发生中,P53突变是最常见的基因改变,其功能缺失是癌症发生的一个主要因素,而WRAP53对P53的调控对P53发挥抑癌功能起着重要的作用。
  WRAP53通过结合到P53 mRNA目标片段上,形成WRAP53-P53杂交使内源性P53 mRNA免受降解,从而来维持P53蛋白的水平和生物学功能。这一过程在人骨肉瘤细胞株U2OS、人乳腺癌细胞株MCF-7和人结肠癌细胞系HCT116等细胞中都有存在,是在转录后水平进行调节的。敲除WRAP53后,P53 mRNA和P53蛋白水平会下降。研究显示,靶向WRAP53α的小干扰RNA(small inter-fering RNAfor WRAP53α,siWRAP53α)可将P53 RNA水平下调83%,而siWRAP53β和siWRAP53γ却没有此功能,且siWRAP53α并不会影响WRAP53的表达水平。这一结果提示,只有外显子1α编码的产物能够调节P53 RNA。研究还显示:P53 mRNA表达水平较WRAP53表达水平高100倍,说明天然反义转录物及其所调节的转录物通常皆是低水平表达的;顺铂即可通过上调WRAP53基因的表达水平从而上调P53的水平,进一步产生抗癌作用。不仅如此,WRAP53基因也可调节突变的P53表达水平。在突变的P53表达的人宫颈癌C33A细胞中,敲除WRAP53基因可使突变的P53 mRNA表达水平降低30%~40%;而这一结果也增大了未来把WRAP53作为靶向目标,治疗与P53突变相关的肿瘤疾病的可能性。
  2 WRAP53蛋白及其功能
  2.1 WRAP53蛋白
  WRAP53蛋白由WRAP53外显子1β转录翻译产生。人类端粒酶大小为0.65~2×109,包括端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)、端粒酶RNA组分(telomerase RNA component,TERC)以及角化不良蛋白(dyskerin,Dys)及其与Dys有关的蛋白质。研究人员通过高灵敏的质谱鉴别技术纯化Dys复合体后发现了WRAP53,并探测其未知功能,如实现端粒酶在CB中的积累、端粒的延长和运动神经元生存蛋白(survival motor neuron,SMN)定位至CB等。
  2.2 WRAP53蛋白的功能
  2.2.1 WRAP53参与CB形成 CB是细胞核内的亚细胞结构,既是球形小体,也是一种核结合细胞器,参与许多核功能,包括核糖核蛋白(ribonucleoprotein,RNP)的成熟、剪接体形成、组蛋白mRNA加工、RNA多聚酶组装、端粒酶起源和组蛋白基因转录等。此外,CB也是内生端粒酶运输的基础。作为CB的主要成分,P80螺线蛋白是其中质量丰度最高的蛋白质,被公认为鉴定CB的标志物。螺线蛋白对CB的形成,稳定其分子组成以及功能发挥都至关重要;而CB中多种分子的相互作用对维持CB的完整性也至关重要,譬如SMN、WRAP53与螺线蛋白定位有关。WRAP53和螺线蛋白为CB必须的结构成分。研究人员在人宫颈癌细胞海拉细胞,人骨肉瘤细胞U2OS,人乳腺癌细胞MCF7等细胞中发现:CB内存在着丰富的WRAP53,WRAP53在CB内与螺线蛋白结合并共同作用,成为CB形成的支架蛋白;在WRAP53缺乏的细胞中,已形成的CB会出现分解,也没有新CB的形成,且螺线蛋白和SMN会在核仁内积累。即WRAP53为CB的基本组成成分,对CB的形成和维持至关重要,可以与螺线蛋白和SMN之间相互作用,参与其在核内的分布。WRAP53通过WD40结构域和包含456~533个氨基酸的C末端区域与螺线蛋白和SMN相互作用,指导WRAP53定位至CB。缺乏上述任何一个结构域,WRAP53无法准确定位至CB。WRAP53过度表达会阻止CB的形成,会导致螺线蛋白和SMN错误定位在核质;而构成CB的螺线蛋白的缺失和过度表达对CB也会产生类似的负面影响。这就进一步说明,WRAP53参与CB的形成。
  2.2.2 WRAP53参与端粒酶的定位端粒酶是一种RNP复合体,参与合成端粒。具有活性的人端粒酶由TERT、TERC和Dys三个核心部分组成。H/ACA结构域存在于TERC和两组非编码RNA中,即小卡侯体相关RNA(small Cajal body-associatedRNA,scaRNA)和小核仁RNA(small nucleolarRNA,snoRNA)中;而Dys是一种可以识别H/ACA结构域的RNA结合蛋白,与TERC结合,可以维持TERC的稳定。
  在人类癌细胞中,端粒酶延长端粒需要多个步骤,包括端粒酶RNA的产生、全酶组装、核内转运和端粒酶转移至端粒等。其过程可能是:首先未组装的TERC和蛋白质,譬如核糖体、剪接体等出现在核仁中并相互结合;接下来端粒酶RNP通过TERC与TERT相互结合产生有活性的端粒酶,且端粒酶RNP通过与TERT作用保留在核仁内;随后端粒酶RNP通过TERC上的CAB保守序列框与WRAP53结合后被运输到CB;最后包含端粒酶RNP的CB与端粒结合,使端粒酶发挥延长端粒的作用。研究显示,端粒酶首先于S期在核仁的致密纤维组分组装形成,通过TERT与核仁蛋白的相互作用被保留在核仁内;随后端粒酶与WRAP53相互作用,从核仁离开并定位至CB。如果WRAP53的质量低于一定阈值,端粒酶与核仁蛋白的结合将增加,从而导致端粒酶留在核仁内。
  端粒酶需要定位至CB,才能发挥延长端粒的功能。WRAP53可通过与TERC上的CAB保守序列框结合,从而指导TERC的定位并在S期将TERC运输至端粒上;而在这一时期,TERT也被招募回CB从而形成有活性的端粒酶,端粒酶活性在S期达到高峰,进一步通过CB分布于端粒上,完成对端粒的延长。这一过程发生在端粒酶核心成分组装完成后;而端粒酶全酶一旦定位在端粒上,其活性还可被端粒保护蛋白1(telomere protectiveprotein 1,TPP1)等加强。其他因素有待进一步研究发现。这一过程可能为人类TERC所特有,因为鼠TERC可不依赖CB独立完成端粒的延长,可能与WRAP53直接与端粒酶运输至端粒过程中相关蛋白质的相互作用有关。
  WRAP53与端粒酶的三个核心组分相互作用,指导端粒酶在CB的定位。WRAP53可以与包含一种4核苷酸序列的scaRNA特异性结合。这种4核苷酸序列被称为CAB保守序列框,既是scaRNA的特征之一,也是CB的定位信号。TERC既是scaRNA家族中的一员,也是端粒酶全酶的一部分。CAB保守序列框位于TERC的3’发夹环上,这可能是端粒酶定位于CB的一个机制。此外,WRAP53与Dys的直接作用也与其指导端粒酶定位到CB有关。Dys与WRAP53的作用不会被RNaseA影响,提示二者间的作用应该是通过蛋白质-蛋白质相互作用实现的;而TERT与WRAP53的结合则对RNaseA敏感,说明端粒酶与WRAP53的作用依赖于TERC。总而言之,WRAP53与大部分TERT和TERC在S期有稳定的联系,因此应该与Dys一样属于端粒酶全酶的一部分。
  WRAP53在核仁内的定位在细胞周期中是动态的。包含WRAP53的端粒酶最初在核仁内于S期早期被组装,之后在S期的中期和后期很快地被转运到核质中的CB。WRAP53的缺乏对TERT、Dys和TERC表达没有影响,对端粒酶的功能也没有影响,但却会减少CB中的端粒酶,最终导致端粒长度难以维持。核仁内的WRAP53对于端粒酶的组装并非必须,而是在组装之后定位至CB的这一过程中必不可少;因此,适当表达的WRAP53控制着端粒酶的准确定位,并且在人类癌症细胞中对端粒的合成尤为重要。
  2.2.3 WRAP53指导SMN定位至CB SMN为一种剪接调控蛋白质,参与小核仁核糖核蛋白(smallnuclear ribonucleoprotein,snRNP)在细胞质的形成,对CB的结构有着重要的影响。输入蛋白(importin)β是一种核输入受体。SMN复合体可通过和输入蛋白β结合使snRNP进入核内并进一步定位至CB,参与CB的形成和成熟。SMN与输入蛋白β的结合可使SMN进入细胞核,而与螺线蛋白的相互作用则可使其定位至CB。WRAP53可指导SMN复合体定位在CB上,并且WRAP53的适当表达对SMN-螺线蛋白和SMN-输入蛋白β复合体的形成非常重要。这些既可以发生在已经形成的CB中,也可以发生在正在形成的CB中,从而调节CB的形成。WRAP53只有与螺线蛋白或SMN相互作用,才可使三者正确定位至CB。
  WRAP53的缺乏将会减少输入蛋白β和SMN的结合,且会减少胞核中的SMN,导致SMN在细胞质内堆积;WRAP53的过度表达则会导致SMN错误地定位至核质;而SMN的缺乏却不会影响WRAP53的分布。曾有研究认为,由于SMN和螺线蛋白有直接结合,所以WRAP53主要是通过缩小相关蛋白质间的距离以便二者结合,而没有真正与二者间相互作用;然而,现在的研究显示,WRAP53和SMN在胞质和胞核中都有相互作用,可以将SMN从胞质运输至胞核。SMN1基因的突变可导致SMN和WRAP53间的结合减少,这一现象在脊髓性肌萎缩症(spinal muscle atrophy,SMA)1型患者中存在,是SMA最严重的类型,也是全世界导致婴儿死亡的重要的基因突变疾病之一。主要是SMN与WRAP53的结合降低,SMN在胞核中减少,且减少的程度也与疾病的严重程度相关。Mahmoudi等发现,在SMA患者的细胞中,SMN与WRAP53的结合减少了83%。
  2.3 WRAP53与肿瘤
  WRAP53在肿瘤细胞系和临床肿瘤样本中普遍高表达,蛋白质量是普通细胞中的20倍。在人鼻咽癌高分化细胞CNE1、人口腔鳞癌衍生细胞系HSC-3、人舌鳞癌细胞CAL-27、腺样囊性癌细胞ACC2中,WRAP53的表达量明显高于健康的牙周膜细胞和牙髓细胞。在海拉细胞、人骨肉瘤细胞U2OS、人肺癌细胞H1299、人结直肠腺癌细胞SW480等肿瘤细胞中WRAP53均高表达,其次在人乳腺上皮细胞株MCF10A表达,而在成纤维细胞HDF、人脐静脉内皮细胞等非转化细胞中表达极为微弱。WRAP53过度表达可使小鼠胚胎成纤维细胞系NIH 3T3培养3周后的细胞克隆增加4倍,克隆的体积也更大,促进健康细胞转化。WRAP53与癌症预后相关,WRAP53表达越高,患者预后越差。沉默WRAP53基因,可明显抑制肿瘤细胞的生长和成瘤能力。稳定低表达WRAP53的头颈鳞癌细胞在体外的增殖能力和侵袭能力被明显降低,细胞周期发生变化;还有研究发现,WRAP53干扰可引发细胞内多个肿瘤相关通路发生变化,如P53、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B、细胞周期及程序性细胞死亡、贾纳斯(Janus)激酶-信号转导子和转录激活子信号转导通路等;WRAP53干扰组细胞形成的移植瘤明显小于对照组,且细胞增殖能力降低、程序性细胞死亡明显增加、新生的微血管数量减少。此外,用WRAP53 siRNA转染肺腺癌细胞A549,可明显抑制WRAP53 mRNA及其蛋白质的表达,从而抑制端粒酶与端粒的结合;下调周期蛋白依赖性激酶CDK6的表达,诱导细胞G1和S阻滞,从而抑制癌细胞增殖。
  在转移性恶性肿瘤中,WRAP53表达活跃的细胞在放射治疗后会发生更频繁的程序性死亡,可能与WRAP53的表达水平较低,易被放射线消耗有关。此外,远处转移肿瘤和原代肿瘤自身在生物学特性和临床特点上也存在着差异。WRAP53缺乏诱导癌程序性细胞死亡的机制可能缘于激发了线粒体途径:主要表现为促程序性细胞死亡基因,B细胞淋巴瘤2相关蛋白X(B-cell lymphoma-2associated protein X,BAX)和 B细胞淋巴瘤2同源拮抗蛋白(B-cell lymphoma-2 homologousantagonist,BAK)信号转导通路的激活,线粒体膜电位和细胞色素c的损耗。此类程序性细胞死亡可被B细胞淋巴瘤2过度表达阻止。WRAP53还与放射线敏感性呈负相关。敲除WRAP53基因的人鼻咽癌低分化CNE2细胞株的放射敏感性明显高于对照组细胞,端粒长度较对照组缩短,提示WRAP53被阻断后,端粒酶不能有效地合成端粒,放射产生的DNA双链损伤无法得到及时有效的修复,从而加速程序性细胞死亡,最终增加细胞的放射敏感性。WRAP53表达越高,放射敏感性越低。
  2.4 WRAP53与先天性角化不良
  先天性角化不良(dyskeratosis congenital,DC)与端粒长度的缩短有关。DC患者有更高的骨髓功能丧失、肺纤维化和癌症风险,且有口腔黏膜白斑、异常皮肤色素沉积和指甲营养不良三个经典的皮肤特征。所有类型的DC都与外周血淋巴细胞内端粒过短有关。DC患者体内的WRAP53基因皆存有错义突变。这种突变,使内生WRAP53的表达水平降低并阻止突变的WRAP53在CB上定位。研究显示:内生WRAP53的降低会引起Dys、TERC等在CB上的定位显著降低,最终导致端粒的缩短;由TERT或TERC突变引起的常染色体显性遗传性DC在症状表现上要更轻一些,譬如患者通常没有上述所说的表皮三联征;而由WRAP53突变引起的常染色体隐性遗传性DC患者通常有典型且严重的疾病表现,通常可早期发作,且期望的生命长度相对较短。
 

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