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G 蛋白偶联的雌激素受体在雄性生殖中的作用分析

作者:2016-08-15 09:27文章来源:未知

  近年来大量研究表明,外源性雌激素( exoestrogens,EEs) 与男性泌尿生殖系统畸形关系密切,是人类隐睾、尿道下裂、精子数量减少、睾丸癌等发病率增高的重要原因。传统观点认为,雌激素主要通过经典的核受体雌激素受体α( estrogen receptorα,ERα) 、雌激素受体β( estrogen receptor β,ERβ)发挥慢速的生物学效应。然而近些年来,许多研究发现雌激素能在数秒至数分钟内完成其生物学效应,并涉及到细胞的第二信使途径,这种“快速的”、“非基因”效应并非由经典的雌激素受体ERα、ERβ所介导。G 蛋白偶联的雌激素受体( G protein-coupledestrogen receptor,GPER) 是迄今为止被发现的最重要的雌激素膜受体,EEs 可通过其反式激活表皮生长因子受体( epidermal growth factor receptor,EGFR) 等信号通路,参与介导这种快速的非基因效应,间接调节基因转录,发挥多种生物学效应。本文就GPER 在雄性生殖系统中的研究现状做一综述,为以后的研究课题提供方向和理论基础。

  1 GPER 的分子结构及亚细胞定位

  GPER 属于G 蛋白偶联受体家族,与经典的雌激素核受体并没有同源性,是一种新型的雌激素受体。多个不同的研究团队从人类B 细胞、脐静脉血管内皮细胞、乳腺癌MCF7 细胞克隆出该蛋白,并分别将其命名为趋化因子受体2( chemokine receptorlike2,CMKRL2)、流激内皮G 蛋白偶联受体1( flow-induced endothelial G-protein coupled receptor1,FEG-1)、G 蛋白偶联受体30( G protein-coupledreceptor 30,GPR30)。2009 年国际药理学联合会( International Union of Pharmacology,IUPHAR) 将GPR30 及其他不统一的称呼正式修订为GPER。研究发现GPER 含有7 次跨膜的高度保守区域,其基因定位于染色体7p22 上。

  通过核酸和氨基酸序列分析后证实GPER 是一个长达2 604 bp、编码375个氨基酸、相对分子质量约42 270的蛋白质,包括一个长1 128 bp 的开放性阅读框架( open readingframe,ORF) 。GPER 广泛分布于人体的正常组织,如中枢神经系统( 皮质、小脑、海马等) 、心脏、肺、肝脏、骨骼肌以及泌尿生殖系统等,同时在某些恶性肿瘤中也高度表达,如甲状腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌等。GPER 的亚细胞定位对于其功能研究具有重要的作用,但目前还存在争议。以往的观点认为GPER 配体结合位点均存在于细胞膜表面,但越来越多的实验研究证实GPER 在胞质中亦有表达。张镟等的研究也发现,GPER主要表达于小鼠睾丸引带细胞的细胞膜和细胞质,免疫电镜显示GPER 主要定位于粗面内质网。GPER 的亚细胞定位还需进一步的深入研究。

  2 GPER 在雄性生殖系统的分布

  GPER 在雄性生殖系统中的表达比较复杂,已发现存在于生殖细胞(精原细胞、精母细胞和精子细胞) 、支持细胞、间质细胞、附睾、睾丸引带细胞等,甚至还高表达于生殖系统肿瘤,如精原细胞瘤、胚胎源性肿瘤以及睾丸间质细胞瘤等。

  2. 1 睾丸GPER 在雄性动物睾丸的分布存在差别,在所研究物种的睾丸中都可以证实GPER 的表达。Royer 等的研究发现GPER 存在于大鼠睾丸的支持细胞中,将17β-雌二醇(17β-estradiol,17β-E2) 作用于其后发现GPER 控制着睾丸支持细胞增殖和凋亡的生理过程。Sandner 等发现在猕猴胚胎期,生精小管血管平滑肌细胞未能见到GPER 的表达,利用Western 印迹及RT-PCR 技术证实在猕猴新生儿期(出生后约5 ~ 6 d) 到婴幼儿期间(约1 岁左右) ,GPER 偶可表达于生精小管血管平滑肌细胞及睾丸间质细胞,直至青春期前(约2 ~3 岁) ,生精小管血管平滑肌细胞和睾丸间质细胞上GPER 合成量大大增加。Oliveira 等利用RT-PCR技术追踪到人类生精小管上GPER mRNA 的存在,并用免疫组化、Western 印迹检测到GPER 在生精小管上的表达,证实GPER 仅表达于二倍体的生精细胞,未能在单倍体的生精细胞中检测到其存在。Fietz等利用原位杂交和免疫组化技术证实GPER高表达于人类睾丸Leydig 细胞,支持细胞仅见微弱表达。随着冰冻切片技术以及新抗体的应用,逐渐发现在大鼠的精原细胞、精母细胞和精子细胞同样存在GPER。此外,Prossnitz 等在小鼠的精囊和前列腺亦发现GPER 的存在。

  2. 2 附睾Martinez-Traverso 等证实在不同品系大鼠的不同发育阶段,GPER 存在于附睾上皮细胞,他们利用免疫组化证实GPER 在不同品系大鼠附睾上皮细胞的分布以体部居多,尾部次之。

  2. 3 睾丸引带睾丸引带是连接于睾丸下级、附睾尾到阴囊或耻骨等处的组织结构,在胚胎期,其形态结构发育与睾丸的发育及下降关系极为密切,睾丸下降不全/发育不良常伴随睾丸引带发育异常。Zhang 等利用免疫组化及Western 印迹检测到GPER 存在于不同发育阶段小鼠的睾丸引带内层疏松间叶组织区,主要表达于引带细胞的细胞膜和细胞质。伴随着睾丸下降的不同阶段,睾丸引带上GPER 的表达呈倒“U”型: 出生前其表达较弱,出生后其表达呈下降趋势。亚细胞定位显示GPER 位于小鼠睾丸引带细胞的粗面内质网上。

  3 GPER 介导的信号传导途径

  现有研究表明,GPER 可以通过多种细胞信号传导途径产生效应。

  3. 1 细胞外信号调节激酶(ERK1 /2) 信号通路ERK1 /2 信号通路是主要的促进细胞增殖和分化的信号途径,包括调控细胞生长、分化、转化、凋亡以及细胞周期等,是丝裂原活化蛋白激酶( MAPK) 信号通路中的一个途径。早年Filardo 等在研究乳腺肿瘤MCF7 细胞中发现,雌激素须通过GPER才能激活ERK 途径。Park 等发现低剂量的17β-E2 可通过ERK 信号通路对前列腺基质细胞起增殖作用,ERK 抑制剂PD98059 可阻断其作用。Bouskine 等发现低剂量的双酚A ( bispheol A,BPA) 和E2-BSA 能促进大鼠精原细胞瘤JKT-1 细胞的增殖,ERK 信号通路抑制剂PD98059 可以抑制E2-BSA 对肿瘤细胞的增殖作用,却无法阻断BPA对肿瘤细胞的增殖功能,而PKA 抑制剂H89 能一起阻断BPA 和E2-BSA 对肿瘤细胞的增殖作用,提示这一快速的非基因效应并非通过单一信号通路引起,而是多种信号通路的共同作用。Lucas 等在不同时间段大鼠支持细胞的研究中,将17β-E2 作用于大鼠支持细胞后发现百日咳毒素( pertussis toxin,PTX) 可阻断ERK 信号通路,抑制抗凋亡蛋白Bcl2 的上调。他们认为这种快速的信号传导通路可能与细胞的凋亡过程相关。Zhang 等利用CCK-8 检测法及Western 印迹发现外源性雌激素己烯雌酚(diethylstilbestrol,DES) 对小鼠睾丸引带细胞ERK1 /2 信号通路存在快速干预作用,从而抑制睾丸引带细胞的增殖。

  3. 2 环磷酸腺苷-蛋白激酶A(cAMP-PKA) 信号通路cAMP-PKA 通路亦是经典的信号通路,PKA 被激活后使多种底物磷酸化,影响着细胞的生理代谢过程,并通过蛋白磷酸化,影响细胞周期。在多种外源性雌激素影响人的精原细胞瘤细胞的研究中发现,低剂量的BPA 和E2-BSA 能促进人的精原细胞瘤JKT-1 细胞的增殖,而PKA 通路抑制剂H89 能阻断其增殖功能。Royer 等也发现GPER 特异性激动剂G1 可以通过cAMP-PKA 信号通路,使cAMP 应答元件结合蛋白(cAMP response elementbinding protein,CREB) 磷酸化,从而促进17β-E2 对大鼠支持细胞的增殖作用。

  3. 3 磷脂酰肌醇3-激酶( PI3K/AKT) 信号通路GPER 也可以通过PI3K/AKT 信号传导通路来发挥其生物学效应。雌激素通过GPER 激活PI3K,诱导膜上PIP3 聚集及新的AKT 蛋白的顺序表达,从而促进细胞的生长和增殖。Royer 等将17β-E2通过GPER 作用于大鼠的支持细胞激活PI3K,引起AKT 磷酸化,同样达到增殖的作用。该磷酸化过程可被PI3K 抑制剂Wortmannin 所抑制,而MAPK 抑制剂U0126 却无法抑制此过程,提示E2 是通过两条独立的信号通路作用于大鼠的支持细胞。

  3. 4 Ca2 + 途径研究表明,GPER 可在多种细胞内介导细胞内钙动员。雌激素与GPER 结合后,短时间内就可以引起细胞内[Ca2 +]i 迅速上升,同样的效应亦出现在使用GPER 特异性激动剂G1 激活GPER 后,它可激活各种Ca2 + 结合蛋白引起细胞内反应,证明GPER 通过调节Ca2 + 途径来实现生物学效应。在雄性生殖系统方面,文献已明确指出外源性雌激素对人精子活力的影响正是通过Ca2 + 途径引起细胞内[Ca2 +]i 升高引起的。张镟等的研究中通过Fluo-3 /AM 荧光标记技术和激光扫描共聚焦显微镜检测到小鼠睾丸引带细胞内[Ca2 +]i,并证实DES 可引起细胞内[Ca2 +]i 迅速上升的快速效应,但这种效应是否通过GPER 实现,目前尚不明确,需进一步深入研究。

  4 GPER 在雄性生殖系统中的作用

  目前已有许多不同种属的动物模型用于研究GPER 在生殖系统的作用。研究者构建了GPER 基因敲除( GPER KO) 的小鼠动物模型,发现GPERKO 的小鼠在心血管系统、内分泌系统、神经系统以及免疫系统都会有不同程度的功能缺失,而下丘脑-垂体-性腺轴却是完整的,但这种全身性的基因敲除无法明确GPER 在某一特定细胞、器官、组织中的功能。研究发现GPER 在雄性生殖系统有着举足轻重的作用。

  4. 1 睾丸睾丸生精小管是精子发生的场所,在对男性睾丸生精小管细胞的培养研究中,Sandner等发现GPER 特异性激动剂G1 可明显抑制生精小管细胞的增殖,GPER 特异性拮抗剂G15 能拮抗其作用,提示GPER 控制着生精小管细胞增殖和死亡的过程,从而间接影响睾丸的生精功能。在对大鼠支持细胞的研究中,GPER 介导E2 引起的快速非基因效应,调节支持细胞的修复和凋亡,影响精子形成和雄性生育能力的整个过程。Sirianni 等利用免疫组化检测到小鼠精原细胞株GC-1 上GPER mRNA 的存在,利用RNA 干扰技术发现雌激素通过GPER 激活EGFR/ERK/fos 信号通路,促进GC-1 细胞的增殖。

  4. 2 附睾附睾是连接于输精管与睾丸生精小管的桥梁,是精子成熟的场所。研究发现β 防御素和脂质运载蛋白在附睾体部高表达,乳铁蛋白和丛生蛋白在附睾体部的表达量相对于头部和尾部也较高。Martinez-Traverso 等认为GPER 调节附睾上皮细胞这些蛋白的区域性表达,并发现附睾体部成熟精子所占的比例与GPER 的表达量呈正相关,提示GPER 对于精子的免疫屏障功能、贮存、促进成熟具有重要的意义。

  4. 3 睾丸引带研究发现睾丸引带是胚胎期与睾丸发育密切关联的重要睾丸外因素,睾丸及其他内外生殖器官的发育与睾丸引带的变化过程关系甚密: 睾丸引带异常通常与睾丸位置、形态、结构以及附睾、阴茎和阴囊等异常关联,并可能与成年后的性、生殖异常以及生殖系统肿瘤发生等相关,即可形成睾丸发育不全综合征(testicular dysgenesis syndrome,TDS) ,EEs 对睾丸引带发育的影响势必是其影响睾丸乃至整个生殖系统发育的一个重要方面。Zhang 等在研究DES 对小鼠睾丸引带的非基因效应影响中发现,DES 对ERK 通路上的p-ERK1 /2的抑制作用可被GPER 特异性阻断剂G15 所阻断,但在加入雌激素受体阻断剂ICI182780 后并没有得到类似的反转现象,提示DES 对睾丸引带的快速非基因效应至少有部分是通过GPER 所介导。

  4. 4 雄性生殖系统肿瘤在众多EEs 对人精原细胞瘤的研究中发现,低剂量的BPA 可通过GPER 对精原细胞瘤JKT-1 细胞起促进增殖作用。Lam等的研究发现,GPER 特异性激动剂G1 能通过GPER 使前列腺癌细胞停止在细胞周期G2,从而抑制前列腺癌细胞的增长。Chimento 等亦发现,通过选择性地激活GPER 能抑制R2C 大鼠睾丸Leydig细胞肿瘤的增殖,促进其凋亡,靶向治疗睾丸肿瘤,从而维持雄性的生育能力。

  5 结语

  大量的研究证实广泛存在的EEs 与雄性生殖系统畸形关系密切,其具体的病理生理机制并不十分明确,许多研究方法尚待改进。近年来,GPER 作为已经明确的雌激素膜受体,对其在不同器官的亚细胞定位及具体的作用效应备受关注,由于动物种属的不同以及细胞发育水平的差异,仍存在较大分歧,但对于深入探讨EEs 对于雄性生殖系统畸形的影响具有重要的意义。通过GPER 研究EEs 影响雄性泌尿生殖系统畸形的非基因效应途径有助于更进一步了解雄性生殖系统畸形的病因和发病机制,基因敲除技术的提高、GPER 特异性激动剂以及拮抗剂的应用很有可能成为重要的手段,为今后在基因水平上继续探讨其与雄性生殖系统的关系,为今后在雄性生殖系统疾病开发新的诊疗思路。

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