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深究DP2 干预对大鼠海马神经元的作用

作者:2015-07-24 09:41阅读:文章来源:未知

  铝为地壳中含量最丰富的金属元素,人类日常生活中应用广泛,主要通过食物、化妆品及建筑材料等途径摄入。经证实,长期摄入大剂量铝会产生严重中枢神经系统毒性,表现为行为和认知功能障碍、神经元损伤,甚至神经退行性变,但其具体机制尚不完全清楚。前列腺素(PGs)是一类多不饱和脂肪酸衍生物,由环氧化酶(COX)催化花生四烯酸(AA)代谢产生,介导一系列生理病理过程。前列腺素D2(PGD2)是大脑中最丰富的PGs,其合酶(PGDS)有脑型PGDS(LPGDS)和生血型PGDS(HPGDS)两种亚型。在中枢神经系统,除少突胶质细胞外,LPGDS高表达于神经元。PGD2与特异性受体DP1和DP2结合后,通过受体介导的信号传递机制而发挥广泛作用。DP1和DP2都是G蛋白偶联受体,分别偶联Gs和Gi蛋白,影响环磷酸腺苷(cAMP)水平而发挥不同作用。有研究报道,在PGD2 致原代大鼠皮层神经元损伤模型中,DP2 拮抗剂BAYu3405未发挥保护作用,推测DP2 可能不介导PGD2 的神经毒性。另也有研究报道,在谷氨酸致原代大鼠海马脑片损伤模型中,DP2激动剂DKPGD2明显升高神经元的LDH漏出率及细胞死亡率,提示DP2介导PGD2的神经毒性。出现此矛盾结果,可能与研究模型不同有关。DP2作为DP受体中的一员,在铝盐致原代培养大鼠海马神经元损伤过程中具体是如何变化的,尚未见报道。目前广泛研究的DP2选择性激动剂主要有DKPGD2、15dPGD2、15dPGJ2,DP2 选择性拮抗剂主要有CAY10471、AM461、AZD1981。参考Yue等的报道,我们选择DKPGD2、CAY10471作为干预药物进行实验。我们前期实验结果表明,铝负荷原代培养大鼠海马神经元损伤模型中,LPGDS表达明显上调,DP2表达明显下调,PGD2 含量明显升高,初步提示LPGDSPGD2DP2信号通路可能参与了神经元损伤过程。在本实验中,我们采用DP2选择性激动剂和拮抗剂分别干预铝负荷神经元,进一步观察DP2在原代培养大鼠海马神经元中的作用。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  1.1.1 实验动物 选取孕期18d左右的SD大鼠,由重庆医科大学实验动物中心提供,合格证书号:SCXK(渝)2012-0002。

  1.1.2 主要试剂与仪器 麦芽酚(阿拉丁,上海),DMEM/F12、DHank′s(Hyclone,美国),B27、Neurobasal培养基、胎牛血清(Gibco,美国),左旋多聚赖氨酸、MTT试剂盒(Sigma,美国),青霉素-链霉素溶液、LDH试剂盒、Fluo3AM(碧云天,上海),山羊抗兔特异性烯醇化酶(NSE)多克隆抗体(博士德,武汉),SP试剂盒、DAB显色剂(中杉金桥,北京),苏木精染液、伊红染液(南京建成,南京),DKPGD2、CAY10471(Cayman,美国),超净工作台(苏州净化设备有限公司),二氧化碳培养箱(ThermoScientific,美国),超纯水系统(Millipore,美国),低温冷冻离心机(ThermoScientific,美国),激光扫描共聚焦显微镜(BioRad,美国),全自动酶标仪(BioTek,美国)。

  1.2 方法

  1.2.1 大鼠海马神经元原代培养 取孕期18d左右的SD大鼠,断颈后迅速剪开腹部皮肤和腹膜,将子宫完全暴露后剪断肌层和脐带,取出胎鼠并立即浸泡于装有75%乙醇的烧杯中。约30s后,将消毒好的胎鼠移入事先准备的DHanks液中,断头取脑,迅速分离出两侧完整海马,放入冰浴的DHanks液中,用眼科剪将海马组织剪碎。加入组织体积5倍左右的0125%胰酶,混匀,37℃培养箱内消化,10min时拿出轻轻吹打数次。20min后,加入同体积的含10%胎牛血清培养液终止消化。200目细胞网筛过滤,收集细胞悬液,800r·min-1离心10min。弃去上清,加入一定量的含10%胎牛血清培养液重悬细胞,制成细胞密度为1×106·L-1的细胞悬液。吸取不同体积细胞悬液分别接种于左旋多聚赖氨酸包被好的培养板、培养皿及培养瓶中,置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。4h后,待神经元贴壁,换含2% B27的Neurobasal培养液继续培养,以后每隔3d半量换液1次。海马神经元培养至d7时长到较好状态,可进行后续实验。

  1.2.2 原代培养大鼠海马神经元的免疫化学鉴定 取6孔培养板中培养至d7的海马神经元爬片(10mm×10mm),弃去细胞培养液用PBS漂洗3次;4%多聚甲醛固定30min,PBS漂洗3次,每次2min;3% H2O2 孵育15min,PBS漂洗3次,每次2min;10%山羊血清封闭,37℃孵育20min,吸干血清,不漂洗;NSE多克隆抗体∶抗体稀释液(1∶50),以PBS代替一抗设空白对照,4℃孵育过夜,PBS漂洗3次,每次5min;生物素标记山羊抗兔二抗,37℃孵育30min,PBS漂洗3次,每次5min;辣根酶标记链霉素卵蛋白素工作液,37℃ 孵育30min,PBS漂洗3次,每次5min;避光条件下,DAB显色10min,自来水终止反应;苏木精染液复染细胞核,3min后自来水返蓝;95%乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片;晾干,镜下观察。

  1.2.3 MTT测定 将96孔培养板中大鼠海马神经元培养至d7进行实验分组,即空白对照组(300μmol·L-1maltol)、铝负荷模型组[100μmol·L-1Al(malt)3]、干预组(Al3+ +10-5、3×10-6、10-6mol·L-1 DKPGD2、CAY10471)。在加入处理因素后继续培养24h,每孔加入20μL的MTT溶液(5g·L-1),37℃培养箱中孵育4h。弃去孔内上清液,加入150μLDMSO,摇床上避光震荡,以充分溶解结晶物,于570nm波长处测定吸光度值(OD值)。

  1.2.4 乳酸脱氢酶(LDH)漏出率测定 将24孔培养板中大鼠海马神经元培养至d7进行实验药物处理(分组同“1.2.3”),继续培养24h后,根据LDH测定试剂盒说明书具体步骤操作,于490nm波长处测定OD值。计算公式:细胞毒性或LDH漏出率/% =(处理样品OD值-样品对照孔OD值)/(细胞最大酶活性的OD值-样品对照孔OD值)×100。

  1.2.5 海马神经元病理形态学观察 将24孔培养板中大鼠海马神经元爬片(10mm×10mm)培养至d7进行实验分组,即空白对照组(300μmol·L-1maltol)、铝负荷模型组[100μmol·L-1Al(malt)3]、干预组(Al3+ +10-5mol·L-1DKPGD2、CAY10471)。在加入处理因素后继续培养24h,弃去细胞培养液,PBS漂洗3次,每次1min;4%多聚甲醛固定30min,PBS漂洗3次;HE染色,镜下观察。

  1.2.6 Ca2+荧光强度测定 将共聚焦专用培养皿中大鼠海马神经元培养至d7进行药物处理(分组同“1.2.5”),继续培养24h。弃去培养皿中培养液,采用Ca2+荧光探针Fluo3/AM标记活细胞内Ca2+,通过激光扫描共聚焦显微镜测定细胞内Ca2+荧光强度。1.2.7 统计学分析 所有实验结果均以珋x±s表示,采用SPSS17.0统计软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析及Dunnett′st检验。

  2 结果

  2.1 原代培养大鼠海马神经元NSE免疫化学鉴定 培养至d7的神经元,在倒置光学显微镜下观察,其胞体饱满有光晕,轴突和树突明显,突起交错连接成网状。经NSE免疫细胞化学染色后,阳性细胞胞体及突起呈棕黄色;苏木精复染后,阳性细胞胞核呈蓝色。随机取6个视野,每个视野挑选100个细胞,计数NSE阳性细胞并计算其所占百分比。统计结果显示,超过95%为阳性细胞(Fig1)。

  2.2 DP2干预对铝负荷原代培养大鼠海马神经元存活力的影响

  2.2.1 DKPGD2对铝负荷原代培养大鼠海马神经元存活力的影响 与空白对照组比较,铝负荷模型组MTT值明显降低(P<001);与铝负荷模型组比较,DKPGD2干预组MTT值明显降低,且有剂量依赖性。

  2.2.2 CAY10471对铝负荷原代培养大鼠海马神经元存活力的影响 与空白对照组比较,铝负荷模型组MTT值明显降低(P<001);与铝负荷模型组比较,CAY10471干预组MTT值明显升高,且有剂量依赖性。

  2.3 DP2干预对铝负荷原代培养大鼠海马神经元LDH漏出率的影响

  2.3.1 DKPGD2对铝负荷原代培养大鼠海马神经元LDH漏出率的影响 与空白对照组比较,铝负荷模型组LDH漏出率明显升高(P<001);与铝负荷模型组比较,DKPGD2 干预组LDH漏出率明显升高,10-5mol·L-1、3×10-6mol·L-1组差异有显著性(P<001。

  2.3.2 CAY10471对铝负荷原代培养大鼠海马神经元LDH漏出率的影响 与空白对照组比较,铝负荷模型组LDH漏出率明显升高(P<001);与铝负荷模型组比较,CAY10471干预组LDH漏出率明显降低(P<001)。

  2.4 DP2干预对铝负荷原代培养大鼠海马神经元病理形态学的影响 HE染色后,在正置光学显微镜下观察,空白对照组海马神经元结构清晰完整,胞体呈锥形或三角形,核仁明显,有双极或多极突起并相互交织成网;铝负荷模型组海马神经元细胞数目明显减少,突起萎缩,部分细胞核固缩;DKPGD2干预组海马神经细胞几乎全部核固缩、裂解;CAY10471干预组海马神经元较模型组神经元结构完整,胞体、胞核明显,裂解细胞明显减少(Fig2、3)。

  2.5 DP2干预对铝负荷原代培养大鼠海马神经元Ca2+荧光强度变化的影响 空白对照组海马神经元的Ca2+荧光强度极其微弱,铝负荷模型组Ca2+荧光强度明显增强(P<001);与铝负荷模型组比较,DKPGD2干预组Ca2+荧光强度有增强趋势,但差异无显著性;CAY10471干预组Ca2+荧光强度明显降低(P<001)(Tab5、Fig4)。

  3 讨论

  铝作为一种公认的神经毒剂,过量蓄积可严重影响人的认知功能,进而诱发一系列神经系统疾病。与三氯化铝、葡萄糖酸铝等其他铝盐相比,麦芽酚铝[Al(malt)3]是一种中性含铝复合物,在生理pH条件能释放出大量Al3+,有利于进行铝负荷神经毒性的相关研究。本实验采用Neurobasal培养基(含2% B27)进行海马神经元的原代培养,通过神经元胞质内特异性标志物NSE的鉴定,其纯度超过95%。参考Chen等[11]并通过我们的前期实验摸索,本实验采用100μmol·L-1麦芽酚铝建立铝负荷大鼠原代海马神经元损伤模型。研究结果发现,与空白对照组比较,铝负荷原代培养大鼠海马神经元MTT值明显降低、LDH漏出率明显升高、Ca2+荧光强度明显增强,海马神经细胞数目明显减少、突起萎缩,部分细胞核固缩。Chen等[12]对麦芽酚铝致原代培养的大鼠皮层神经元损伤进行了研究,发现Al3+通过激活RhoRock信号通路诱导神经毒性。Johnson等[13]在原代培养的大鼠海马神经元中发现,麦芽酚铝可造成神经元呈时间和剂量依赖性凋亡,其作用机制可能与麦芽酚铝抑制脑源性神经生长因子(BDNF),导致细胞内Ca2+升高有关。

  我们实验结果还发现,与铝负荷模型组相比,DKPGD2干预组MTT值明显降低、LDH漏出率明显升高、Ca2+荧光强度有增强趋势,海马神经细胞几乎全部核固缩、裂解;CAY10471干预组MTT值明显升高、LDH漏出率明显降低、Ca2+荧光强度明显减弱,海马神经元较模型组神经元结构完整,胞体、胞核明显,裂解细胞明显减少。有研究报道,DP2 偶联Gi蛋白,通过激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K),磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Ser50/Thr145),激活糖原合成酶3(GSK3),活化T细胞核因子的转换,释放炎性介质。也有研究报道,DP2被激活后偶联Gi蛋白,抑制cAMP水平,促进Ca2+ 内流,上调CD11b表达,诱导嗜碱性粒细胞迁移和脱颗粒,促进IL2、IL4、IL5、IL13的释放。Liang等[5]对天冬氨酸(NMDA)致原代海马神经元损伤进行了研究,发现DKPGD2 加重神经元损伤。Schroder等[16]对炎性相关因子前列腺素H1(PGH1)进行了研究,发现CAY10471可抑制Th2细胞的迁移。结合本实验结果,DKPGD2可能通过激动DP2,偶联Gi蛋白,增加细胞内Ca2+浓度,加重铝负荷原代培养大鼠海马神经元损伤;CAY10471可能通过抑制DP2活性,减少Ca2+流入,对铝负荷原代培养大鼠海马神经元损伤起一定保护作用。

  综上所述,DP2 激活表达可增加神经元对铝盐损伤的易感性,其机制可能涉及DP2下游Ca2+信号通路的调控,但由于作用复杂,在神经系统中的机制尚不完全清楚。因此,在本研究的基础上,可对DP2在神经系统中介导的下游Ca2+信号通路的具体调控机制进行深入研究。

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