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探讨不同来源的细胞因子诱导的杀伤细胞体外抗肿瘤作用的比较研究

作者:2017-06-03 18:16阅读:文章来源:未知
  细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killercells,CIK)是一群异质性的具有抗肿瘤作用的细胞。CIK 细胞主要表达CD3 和CD56, 抗肿瘤活性强,增殖迅速。用患者自身PBMC 诱导的CIK 细胞已经显示良好的临床疗效,尤其对慢性髓系白血病、肝癌、结直肠癌、肾癌、肺癌、乳腺癌等。但是肿瘤患者在经历了放化疗后,经常出现白细胞减少、贫血等症状。尤其晚期恶性肿瘤患者每毫升外周血中单核细胞的数量也较正常人少。因此为了减轻患者负担,提高临床疗效,本研究比较了来自健康捐助者的脐血CIK 细胞和来自肺癌患者外周血的CIK 细胞在体外的抗肿瘤作用,并初步探讨了其机制上的差异,以寻找更有效可行的CIK治疗方法。
  1 材料与方法
  1.1 材料来源
  白血病细胞系K562 和肺癌细胞系A549 由吉林省肿瘤防治研究所常规传代培养。Recombinant human interleukin (IL) -2、IFN-γ、CD3 -mAb (OKT -3)、IL-1α 购自Biolegend。PI、anti-CD3-ECD、anti-CD56-PC5、anti -CD8 -PC5、anti CD3 -FITC、anti -CD8 -FITC及相应的同型对照抗体均购自贝克曼库尔特公司。5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidy ester(CFSE)购自Molecular Probes。Annexin V apoptosis kit 购自BD公司。MonensinSolution(BioLegend,Cat.420701)。PEanti-human CD107a (Lysosome-Associated MembraneProtein 1,LAMP-1,BioLegend,Cat. 328608,Clone: H4A3)。CCK-8 购自碧云天生物技术公司。
  1.2 方法
  1.2.1 诱导培养CIK 细胞肺癌患者外周血(4 份,
  10 mL/份)来自吉林省肿瘤医院住院患者(2014 年8 月~2015 年8 月);4 份脐血(10 mL/份)来自吉林省妇幼保健院(2014 年8 月~2015 年8 月)。血液样本分别经红细胞裂解液处理后, 获得的细胞被培养在IMDM 培养基中(10% FCS,37℃,5%CO2饱和湿度),细胞浓度(1~2)×106/mL。培养24 h 后,加入1000 U/mLIFN-γ,CD3-mAb (50 ng/mL),IL-2(300 U/mL),IL-1α(100 U/mL),继续培养并每3 天半量换液或扩瓶1 次,同时补加IL-2(300 U/mL)。在培养的第14 天和第21 天收获细胞,流式细胞仪检测分析(BeckmanCoulter Epics XL-MCL) 细胞表型, 即CD3+CD56 + 、CD3+CD8+ 细胞百分率。
  1.2.2 CIK 细胞增殖实验采用CCK-8 染色法检测诱导培养21 d 的脐血CIK 细胞和来自肺癌患者外周血的CIK 细胞的增殖率。调整CIK 细胞的初始密度为5×104/mL,37℃、5% CO2培养箱中培养,每3 天扩瓶1 次,CCK-8 染色, 酶标仪检测(490 nm), 直到第21 天,计算增殖率并分析比较实验结果。
  1.2.3 CIK 细胞体外抗肿瘤活性实验(流式细胞仪法)
  标记靶细胞:A549 和K562 细胞用PBS 洗1 遍,调整细胞浓度为1.5×106/mL,CFSE(2.5 μmol/L) 标记细胞,37℃孵育8 min,PBS 洗细胞1 次,加入1 mL IMDM(含10% FCS),室温避光孵育10 min,再加入PBS 洗细胞1 次备用。标记效应细胞:调整CIK 细胞浓度为1×106/100 μL,标记用CD3、CD8 和CD56 抗体,室温避光孵育30 min,细胞用PBS 洗1 次备用。调整靶细胞密度为5×104/mL,设置不同的效靶比,分别为1∶1、5∶1、10∶1,相应的CIK 效应细胞浓度分别为5×104/mL、25×104/mL、50×104/mL,分别设单独的靶细胞和效应细胞对照,37℃、5% CO2培养箱中培养24 h 后,PI 染色,流式细胞仪检测分析。
  1.2.4 CIK 细胞体外抗肿瘤活性实验(MTT 法) 按上述同样的效靶比将细胞接种于96 孔板中, 靶细胞浓度为2×104/孔,37℃ 5% CO2培养箱中培养24 h 后,加入CIK 细胞,MTT 法检测CIK 对靶细胞的杀伤效率。酶标仪检测490 nm 处吸光度(A)值。抑制率(%)=[1-(实验组A 值-CIK 细胞A 值)/肿瘤细胞A 值]×100%。
  1.3 观察指标
  1.3.1 检测CIK 细胞CD107a 表达调整CIK 细胞浓
  度为1×106/100 μL,加入CD107a-PE(10 μL),37℃,5% CO2培养箱中培养1 h 后,加入Monensin,将效应细胞和靶细胞按10∶1 的效靶比混合,37℃,5% CO2培养箱中培养3~4 h,PBS 洗细胞1 次,标记细胞用相应的CD3、CD8 和CD56 抗体,2%多聚甲醛固定细胞,流式细胞仪检测分析。实验设阴性对照(单独CIK 组)以控制自发产生的CD107a。
  1.3.2 细胞因子的检测按前述方法将10∶1 混合的效靶细胞(A549) 培养24 h 后,ELISA 法检测培养上清中IFN-γ 和TNF-α 表达。
  1.3.3 细胞凋亡实验按前述方法将10∶1 混合的效靶细胞(K562)培养24 h 后,收集细胞,Annexin V/PI 染色,流式细胞仪检测分析,每个样本收集10000 个细胞。数据分析采用Coulter EXPO 32 v1.2 软件。
  1.4 统计学分析
  数据分析采用SPSS 17.0 统计学软件,计量资料以(x±s)表示,组间比较采用方差分析、t 检验及配对t检验,P<0.05 为差异具有统计学意义。
  2 结果
  2.1 流式细胞术检测诱导培养的CIK 细胞表型来自肺癌患者外周血和脐血的CIK 细胞在诱导培养的第14 天和第21 天的细胞表型检测结果表明,随着培养的延长,CD3+细胞、CD3+CD56+和CD3+CD8+细胞百分比升高。培养第14 天时,来自肺癌患者外周血CIK 细胞的CD3+细胞、CD3+CD8+和CD3+CD56+细胞百分比分别为(86.00±5.25)%、(66.88±2.56)%、(14.90±5.79)%;脐血CIK 细胞的CD3+细胞、CD3+CD8+和CD3+CD56+细胞百分比分别为(90.68±1.77)%、(69.00±7.60)%、(20.13±3.09)%。培养第21 天时,来自肺癌患者外周血CIK 细胞的CD3+细胞、CD3+CD8+和CD3+CD56+细胞百分比分别为(91.13±5.48)%、(70.58±2.49)%、(14.98±5.53)%;脐血CIK 细胞的CD3+细胞、CD3+CD8+和CD3+CD56+细胞百分比分别为(96.83±1.18)%、(76.15±5.78)%、(21.35±2.70)%。虽然脐血CIK 细胞的CD3+、CD3+CD8+和CD3+CD56+细胞百分比高于肺癌患者外周血来源的CIK 细胞,但二者之间差异无统计学意义(CD3+细胞百分比:P=0.1348;CD3+CD8+细胞百分比:P=0.0836);CD3+CD56+细胞百分比:P=0.1269。
  2.2 CIK 细胞增殖实验结果
  本研究使用CCK-8 染色实验检测CIK 细胞的增殖能力,培养21 d 的肺癌患者外周血和脐血来源的CIK 细胞增殖率分别为(185.76±39.68)%、(254.32±74.60)%,二者之间差异有统计学意义(P=0.0012)。
  2.3 CIK 细胞体外抗肿瘤活性实验(流式细胞仪法)结果
  CIK 细胞与肿瘤细胞共孵育后,CIK 细胞表面CD3、CD8、CD56 的表达率与单独CIK 对照组相比没有发生明显变化。以死亡的靶细胞标记为CFSE+PI+为依据,进一步比较来自肺癌患者和脐血的CIK 细胞的抗肿瘤活性,结果表明,二者对A549 和K562 细胞均有抑制作用,来自脐血的CIK 细胞有更强的抗肿瘤作用。
  2.4 CIK 细胞体外抗肿瘤活性实验(MTT 法)结果根据公式计算来自肺癌患者外周血和脐血的CIK 细胞对A549 和K562 细胞的体外生长抑制率,结果显示肿瘤患者自体CIK 细胞和脐血CIK 细胞均有不同程度的抗肿瘤效应且随效靶比的升高而增加;效靶比相同时,脐血CIK 细胞的体外抑瘤活性高于来自肺癌患者的CIK 细胞。2.5 检测CIK 细胞CD107a 表达实验结果本研究通过检测CD107a 的表达来间接说明CIK细胞的细胞毒性功能,实验结果表明,脐血CIK 细胞CD107a 表达高于来自肺癌患者外周血的CIK 细胞(图4)。2.6 检测CIK 细胞分泌的细胞因子ELISA 法检测CIK 细胞分泌的IFN-γ 和TNF-α,脐血CIK 和肺癌患者CIK 分泌IFN-γ 分别为(185.25±30.45)pg/mL 和(148.72±35.83)pg/mL,两者比较差异有统计学意义(P=0.0352);TNF-α 分别为(20.85±4.58) pg/mL 和(14.88±3.32)pg/mL,两者比较差异有统计学意义(P=0.0389)。
  2.7 流式检测肿瘤细胞凋亡实验结果
  本研究用Annexin V/PI 双染色检测来自肺癌患者外周血来源的CIK 细胞和脐血CIK 细胞对K562细胞凋亡的影响。脐血CIK 细胞诱导的K562 细胞凋亡的百分率[Annexin V+PI-细胞:(25.30±4.87)%]高于肺癌患者的CIK 细胞[Annexin V+PI-细胞:(19.87±5.41)%],但是统计学分析结果显示二者之间差异无统计学意义(P=0.2658)。
  3 讨论
  细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)临床治疗恶性肿瘤的安全性和可行性已被很多基础和临床试验确认。CIK 细胞是异质性的细胞群体,包括CD3+CD56+、CD3+CD56-、CD3-CD56+细胞群,其中CD3+CD56+ 细胞来自CD3+CD56- T 细胞,主要负责非主要组织相容性复合体(MHC)限制性的抗肿瘤活性。体外诱导培养的CIK 细胞是单个核细胞在CD3 单抗和多种细胞因子(包括IFN-γ、IL-2 等)作用下产生的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群,既具有T 淋巴细胞强大的抗肿瘤活性,又具有NK 细胞的非MHC限制性肿瘤杀伤能力,杀瘤活性高、杀瘤谱广。目前,对于CIK 细胞大规模制备应用和总体疗效的评估已经达成一定的共识。本研究在前人经验的基础上,比较了来自脐血和肺癌患者外周血来源的CIK 细胞体外抗肿瘤作用及机制的差异,以期为CIK 细胞的临床应用提供更多的实验依据。本研究实验结果表明,与肺癌患者CIK 细胞相比,脐血来源的CIK 细胞表达CD3+CD56+、CD3+CD8+ 的比例更高,具有明显增强的抗肿瘤作用和增殖能力,同时伴随增加分泌IFN-γ、TNF-α。IFN-γ 能够调节机体的免疫力,抑制病毒复制,抑制肿瘤细胞的增殖;TNF-α 除能够诱导肿瘤细胞凋亡之外,还能够促进细胞毒性T 细胞的分化以及其他效应因子,如IL-2、IFN-γ 等的产生。CIK 细胞的抗肿瘤机制主要通过效靶细胞的接触,CIK 细胞表面的黏附分子,白细胞功能相关抗原-1(leukocyte function-associated antigen-1,LFA-1)与肿瘤细胞表达的LFA-1 配体结合, 导致对肿瘤细胞的细胞毒作用;CIK 细胞活化的信号通路主要涉及NK细胞受体与肿瘤细胞表达的配体的结合和被活化,最终导致对肿瘤细胞的脱颗粒和细胞毒性;此外,CIK 细胞由Fas 配体通过Fas 信号通路诱导肿瘤细胞凋亡。效-靶细胞接触后,微管的极化运动会将溶解性颗粒运输到细胞之间的免疫突触中。颗粒一旦到达效应细胞的质膜,质膜就会溶解,颗粒即被释放到免疫突触中,最终导致靶细胞死亡。CD107a(LAMP-1)、CD107b(LAMP-2)是溶酶体相关膜糖蛋白(LAMPs)。效应细胞的脱颗粒作用导致细胞内的细胞毒性颗粒膜上存在的CD107a 和b 暴露在细胞表面,这一过程与细胞内穿孔素的流失相关,也与细胞内IFN-γ 的产生相关。因此检测CD107a 和CD107b 的表达可以更全面的分析CIK 细胞的功能。本研究的结果证实了脐血CIK 细胞CD107a 的表达高于来自肺癌患者外周血的CIK 细胞。
  目前流式检测技术已广泛应用于基础实验和临床研究,使用流式细胞仪可以检测单个细胞水平的增殖, 敏感性大大提高,而且结合单抗标记可以反映不同的细胞亚群的增殖、功能和作用机制,提供的信息更为丰富,同时也大大提高工作效率。本研究的技术路线就是采用流式细胞术同时检测脐血CIK 和肺癌患者来源的CIK 细胞表型、功能和肿瘤细胞的凋亡等,使实验结果的准确性和一致性明显提高。如CIK 细胞的体外抗肿瘤实验采用流式检测和MTT 法同步进行,流式细胞术所获得的检测结果与MTT 法相比敏感性和重复性更佳。
  综上所述,本研究为临床应用CIK 治疗提供更多选择和实验室依据。后续的研究需要进一步比较不同来源的CIK 细胞在作用机制上的差异,最终为提高临床疗效提供证据。
 

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