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藤梨根乙醇提取物联合CIK 细胞对胃癌细胞SGC-7901 杀伤作用的讨论

作者:2017-02-23 10:37阅读:文章来源:未知
  中医药和生物治疗作为晚期胃癌的辅助疗法,既能提高化放疗的近、远期疗效,又能减轻其不良反应,所以在晚期胃癌的治疗中必不可少。CIK 细胞治疗是发展最为迅速的过继免疫疗法,其疗效在国际上己得到广泛认可。藤梨根最早见于《开宝本草》,又名猕猴梨根、猕猴桃根或阳桃根,为猕猴桃科软枣猕猴桃的根。《青岛中草药手册》言:性平,味甘、微酸。入足少阴、阳明经。具有健胃、清热解毒和利湿的功效,适用于湿热黄疸和消化不良等症。并擅长祛风除湿、消痈医疡和活血利尿消肿,治疗风湿痹痛、关节肿痛、淋浊带下、瘰疬、痢疾、疮疖和水肿等症,有抗癌作用,主要用治胃癌和食管癌等消化道癌肿。相关研究已证实藤梨根和CIK细胞单独作用胃癌细胞均有直接杀伤和诱导凋亡的作用。在相似的抗肿瘤机理前提下,如何发挥各自的优势,最大限度地抑瘤杀瘤,值得深究。本研究以抗肿瘤中药藤梨根为例,初步探讨其乙醇提取物与CIK 细胞在体外联合对胃癌细胞SGC-7901 生长的影响,为两者联合运用奠定理论基础。
  1 材料
  1.1 主要仪器及试剂
  主要仪器:CO2 细胞培养箱( 日本SANYO 公司)、倒置显微镜XSD-1( 重庆光学仪器厂)、酶标仪Skan Ascent( 美国thermo 公司)。试剂:注射用重组人干扰素-γ( 上海凯茂生物医药有限公司,批号:S10980084)、注射用重组人白介素-2( 山东泉港药业有限公司,批号:S20020006)、重组人白介素1α( 美国Pepro Tech EC Ltd 公司)、注射用抗人T 细胞CD3 鼠单抗( 武汉生物制品研究所,批号:S19990012)、RPMI1640(GIBCO 公司,批号:22409-015)、二甲亚砜(DMSO)( 美同Sigma 公司,批号:D4540-500ML)、四甲基偶氮唑盐(MTT)( 美国Sigma 公司,批号:CGD-17H294,以超纯水配成5 mg/ml,避光、分装保存)、胰蛋白酶(Tripsin)(Difco公司,批号:215250)、胎牛血清、冷乙醇、PI。
  1.2 细胞株
  本研究中使用的胃癌细胞SGC-7901 购自科学院细胞库,长期冻存于-196℃液氮或短期存放于-80℃冰箱中。用前取出溶解,常规培养于含10%胎牛血清的RPMI1640 完全培养液内,置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。取第3、4 代对数增长期的细胞用于试验。
  1.3 中药
  将购置的藤梨根乙醇提取物粉末1 g 加DMSO2 ml 溶解得到生药浓度500 mg/ml,分装后置4℃冰箱冷藏备用。临用前用含10% 胎牛血清的完全培养液稀释到所需的工作浓度。1.4 CIK 细胞
  CIK 细胞的制备参照相关文献,用淋巴细胞分离液离心提取20 例健康人的外周血单个核细胞(PBMC)1 ~ 2×107 个,PBS 洗涤后,将细胞重悬并保存于由血清、谷氨酰胺、链霉素和青霉素所组成的RPMI1640 培养液内,调整密度2×106 个/ml,开始时加入1.5×106 U/L 的IFN-γ,孵箱中培养24 h 后,加入100 μg/L 的抗CD3McAb、5×105 U/L 的IL-2和1.0×105 U/L 的IL-1α。继续培养,以后每2 ~ 3 d换液,同时补加IL-2,调整为1.0×106 个/ml,分别于培养初始第7、14、21 和28 d 收集细胞,用间接免疫荧光染色的方法,在流式细胞仪上分析CD3+CD56+ 双阳性细胞即CIK 细胞的百分比。
  2 方法
  2.1 倒置显微镜下观察细胞形态取2×l05 个/ml 的SGC-7901 细胞接种于6 孔板内培养,设2 板。待其贴壁后,第1 板分别加入终浓度为1 和2 mg/ml 的藤梨根醇提物,对照组换取新鲜培养液;第2 板加入效靶比(CIK 细胞与SGC7901的比值) 为20 ︰ 1 和10 ︰ l 的CIK 细胞,靶细胞组只加新鲜培养液,另设效应细胞对照孔。孵箱中培养24 和48 h 后,加入冷乙醇和PI,固定细胞形态,倒置显微镜下观察并照相。
  2.2 MTT 法测定细胞增殖抑制率
  2.2.1 藤梨根乙醇提取物对 SGC-7901 的抑瘤作用取1.0×104 个/ml 的SGC-7901 细胞, 均匀接种于96 孔平板中,置孵箱24 h 待贴壁后,各孔分别加入不同浓度的含藤梨根醇提取物的完全培养液100 μl,使孔内终浓度分别为0.5、1、2 和4 mg/ml,并设完全培养液调零组和只含细胞不加药物的完全培养液对照组,每组设4 个复孔。培养24 和48 h后,各孔中加入MTT 20 μl,继续培养4 h,弃培养液,每孔再各加入150 μl 的DMSO 溶解液,震荡20 min,用酶标仪测定λ = 492 nm 波长处的吸光度(A值)。上述步骤再重复2 次,所测的结果代入下面公式计算:生长抑制率= ( 对照组A 值-试验组A值-调零组)/( 对照组A 值-调零组)×100%。
  2.2.2 CIK 对SGC-7901 的杀伤作用同一批SGC-7901 细胞,每孔1.0×104 个均匀接种于96 孔平板内,贴壁24 h 后,加入效靶比为5 ︰ l、10 ︰ l、20 ︰ l 和40 ︰ l 的CIK 细胞各100 μl,并另设单独靶细胞及效应细胞为对照孔,每组设4 个复孔,置孵箱中培养。24 和48 h 后,每孔加MTT20 μl, 继续培养4 h, 弃上清, 每孔各加DMSO150 μl,同样上酶标仪检测OD 值,重复2 次,用如下公式计算CIK 的杀伤率:杀伤率= [1-( 试验孔A值- 效应细胞孔A 值)/ 靶细胞孔A 值)]×100%。
  2.2.3 藤梨根乙醇提取物 +CIK 对SGC-7901 的杀伤作用调整SGC-7901 细胞浓度1.0×104 个/ml, 各100 μl 在96 孔平板中接种,待贴壁后,先加入终浓度为1 和2 mg/ml 的藤梨根醇提物各100 μl,过4 h,再加入效靶比为10 ︰ l 和20 ︰ 1 的CIK 细胞各100 μl,同时设对照孔,每组4 个复孔,24 和48 h后MTT 法检测,计算方法:杀伤率= [1-( 试验孔A 值-效应细胞孔A 值)/ 靶细胞孔A 值)]×100%。
  2.2.4 统计学处理
  各组数据用均数 ± 标准差(x-± s) 来表示,采用SPSS18.0 统计软件处理数据。组间差异比较选用双向方差分析(Two-Way ANOVA),两组联合与单独作用之间的比较采用拉丁方试验设计资料的方差分析。P < 0.05 为差异有统计学意义,P < 0.01 为差异有显著统计学意义。
  3 结果
  3.1 藤梨根乙醇提取物单独作用后的胃癌细胞SGC-7901 的形态表现及MTT
  结果
  3.1.1 藤梨根醇提物作用后的胃癌细胞SGC-7901 的形态表现倒置荧光显微镜下观察发现24 h 后,对照组细胞仍呈梭形或多边形,贴壁生长,形态饱满,铺满视野。而经藤梨根作用后的胃癌细胞在数量上有所减少,细胞脱壁漂浮或见细胞碎片,在部分视野中可见到凋亡小体,且药物浓度越高、时间越长,越明显。
  3.1.2 藤梨根醇提物对胃癌细胞 SGC-7901 的增殖抑制作用经藤梨根作用后的胃癌细胞SGC-7901,其增殖受到不同程度的抑制。在同一浓度作用下,当延长作用时间,抑制作用呈上升趋势(P < 0.01) ;同一作用时间下,增殖抑制率与浓度成正比例(P< 0.01)。药物作用24、48 h 后的半数抑制浓度(IC50) 分别为2.16 和1.49 mg/ml。
  3.2 CIK 细胞单独作用胃癌细胞SGC-7901 的形态学表现及MTT 结果3.2.1 CIK 细胞作用后的胃癌细胞SGC-7901 的形态学表现在倒置荧光显微镜下观察发现,与CIK 细胞共育24 h 后的胃癌细胞失去原有形态,出现皱缩,漂浮,而且数量减少,48 h 后漂浮的细胞更多,视野中有较多细胞碎片。而对照组生长良好,均匀贴壁,铺满视野。
  3.2.2 CIK 细胞对SGC-7901 胃癌细胞的杀伤表现同一时间下,CIK 细胞的杀伤效应随着效靶比的增加而增强(P < 0.01) ;同一效靶比下,杀伤率与作用时间成正比,各组的杀伤率48 h 均高于24 h(P < 0.01)。
  3.4 藤梨根醇提物联合CIK 细胞对SGC-7901 的增殖抑制作用
  在藤梨根浓度相同的前提下,效靶比20:1 的CIK 细胞的杀伤率均要高于10:1 的CIK 细胞(P <0.05) ;CIK 细胞效靶比一定的基础上,各个浓度之间的增殖抑制率也有差异(P < 0.05)。24 h 与48 h结果对比,当藤梨根浓度为2 mg/ml,效靶比为10:1的试验组,24 h 与48 h 之间无统计学差异,其余各组均有差异(P < 0.05)。尤其当浓度为1 mg/ml,效靶比相同时,24 h 组杀伤率均强于48 h 组(P <0.01)。
  4 讨论
  藤梨根系猕猴桃科植物猕猴桃的干燥根。性寒、苦涩,可活血消肿、清热利湿、祛风利尿。民间主要用于治疗跌打损伤、肝炎、风湿性关节炎、痢疾、水肿等疾病。当代药理学研究阐明其具有抗肿瘤、清除氧自由基、保肝降酶、提高免疫力、抗炎、抗HIV 病毒和降血脂等多种活性,药用价值很高。抗肿瘤作用包括直接杀伤、诱导肿瘤细胞凋亡、调节信号转导通路、协同化疗药逆转MDR 和化疗药物增敏等。
  CIK 细胞是过继免疫疗法的主要免疫活性细胞,相关研究认为其在体外经多种细胞因子共培养数日后可大量扩增,免疫抑制剂FK506 和环孢素虽然对抗CD3 单抗介导的CIK 细胞脱颗粒过程有抑制作用,但对靶细胞诱导的脱颗粒过程却无影响,因此不会影响CIK 的杀伤活性。在CIK 细胞被激活时,可结合靶细胞,同时向胞质内释放含BLT 酯酶的胞浆毒性颗粒,后者直接穿透靶细胞膜进行胞吐,裂解靶细胞。经活化后的CIK 可分泌IL-2、IL-6、GM-CSF、TNF 和IFN-γ 等多种细胞因子,参与机体的免疫应答间接抑制肿瘤细胞。在诱导肿瘤细胞调亡方面,Hoyle 等 研究认为CIK 细胞能促使FasL的合成,提示其既可诱导FasL 阳性肿瘤细胞本身凋亡。研究发现其诱导胃癌细胞凋亡可能与上调Bax 或下调Bcl-2、p53 和C-myc 蛋白的表达有关。
  本研究发现,藤梨根能有效杀伤胃癌细胞,对其有较强的增殖抑制作用,且有浓度和时间依赖性,浓度越高,时间越长,作用越突出,与文献报道一致。CIK 细胞杀伤胃癌细胞SGC-7901 的效应与效靶比和作用时间均有关,随着效靶比的递增,作用时间的延长,杀伤活性亦随之增强,当效靶比为40:1,作用48 h 时,CIK 细胞表现出较高的杀伤率,可能是通过接触、胞吐和裂解靶细胞发挥杀伤作用。采用拉丁方试验设计分析两者联合与单独作用结果,藤梨根加CIK 细胞组与单独藤梨根醇提物作用组相比,其浓度影响不大,而与培养时间和CIK的效靶比有关(P < 0.05)。与单独CIK 细胞作用组相比较,在作用时间上无差异,与加入的藤梨根浓度有关。当加入2 mg/ml 的藤梨根醇提物时,杀伤率无差异,而加入1 mg/ml 时作用最为显著,高于两者的单独作用(P < 0.01)。提示藤梨根醇提物在浓度为1 mg/ml,CIK 细胞效靶比为20:1,作用24 h时有协同杀伤作用。再提高藤梨根浓度或延长作用时间,杀伤活性不增强,考虑可能系藤梨根本身对CIK 细胞有一定的影响,当其浓度提高到一定程度,在抑制胃癌细胞的同时也可能影响了CIK 细胞的抗瘤活性。
  藤梨根对胃癌细胞SGC-7901 有明显增殖抑制作用,但其成分复杂,大多停留在其提取物及可能机制上,未提取到有效的单体,且真正起抗肿瘤作用的成分仍然不够明确,所以联合CIK 细胞的协同杀伤机制还需更深入的研究。
  5 结论
  藤梨根乙醇提取物与CIK 细胞在一定的浓度与时间下联合作用可表现出一定的协同杀伤胃癌细胞作用,值得研究。
 

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