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谈西洋参胶囊对手机频率电磁辐射大鼠肝脏组织氧化损伤及Nrf2蛋白表达的影响

作者:2017-02-23 10:36阅读:文章来源:未知
  手机电磁辐射对健康的影响逐渐引起诸多学者重视和关注,研究证实手机电磁波对机体多种器官有不利影响。核因子相关因子-2(nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)是介导细胞保护性蛋白表达、调节体内氧化应激的关键靶点,对外源性毒物尤其敏感,可保护多器官组织细胞正常功能,通过观察对Nrf2的影响可研究中药抗辐射和器官保护的效果。
  肝脏是腹腔最大的实质性器官,易受各病原体、毒物和环境因素影响。氧化损伤是造成肝损伤的重要原因之一,丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(L-Glutathione,GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSHPX)的变化可反映组织的氧化损伤,手机电磁波对机体的不良影响是否与影响肝氧化损伤相关酶和Nrf2蛋白表达有关目前尚未见报道。中医学认为,各种电磁辐射(包括手机辐射)应属环境毒邪,具有火(温)热性质,可耗气损阴。西洋参具有补气养阴,清热生津作用。本研究拟模仿手机发射频率和平均功率密度(900MHz,370μm/cm2)制作大鼠手机频率电磁辐射肝损伤模型,以常用保肝药物水飞蓟宾为对照,通过观察手机频率电磁辐射对大鼠肝组织形态学、肝氧化损伤相关指标及Nrf2蛋白表达的影响,探讨手机频率电磁辐射对大鼠肝Nrf2表达的影响及西洋参对其防护效果。
  材料与方法
  1 动物
  清洁级SD雄性大鼠40只,3~4月龄,体重(300±26)g,购自河北医科大学实验动物中心,动物合格证号:SCXK(冀)2008-1003。
  2 主要药物
  水飞蓟宾胶囊(水飞蓟宾,35mg/粒,天津天士力制药股份有限公司生产,批号:120712)、西洋参胶囊(总皂苷,590mg/粒,汤臣倍健股份有限公司生产,批号:20120704)。将30粒水飞蓟宾胶囊溶于蒸馏水制成100mL混悬液,生药浓度10.5mg/mL;将8粒西洋参胶囊(每8粒相当于生药3g)溶于蒸馏水制成240 mL 混悬液,生药浓度12.5mg/mL,置于4℃ 冰箱中密闭保存。
  3 试剂及仪器
  MDA、SOD 批号:20131126;GSH、GSH-PX测试盒,批号:20131128,均购自南京建成生物工程研究所。Nrf2兔抗大鼠单克隆抗体和免疫组化(SABC 法)试剂盒(Anbo BiotechnologyCompany,美国);羊抗兔生物素化IgG(Vector,Bruling ame,美国);ABC 试剂盒(Vector,Bruling ame,美国);兔抗鼠β-actin:杭州华安生物技术有限公司,批号:611-131-122。辐射装置参照前期研究方法,辐射源由河北师范大学物理系仿制(常用手机频率为900MHz,平均功率密度为370μW/cm2),使用电磁辐射测定仪测定暴露参数,电子式定时器设定辐射时间。将塑料质大鼠笼置于长方形外包细铁丝网的木质辐照箱内。紫外可见分光光度计,型号:SPECTRONIC GENESYS,美国Milton Roy公司;电泳仪系统,型号:DYCZ-24DN,北京六一仪器厂;半干转膜仪系统,型号:WSE-4040,日本ATTO公司;UVP凝胶成像系统,型号:CA91786U.S.A UVP GDS-8000System,美国thermo公司。HMIAS-2000高清晰度彩色医学图像分析系统:武汉千屏影象技术有限责任公司。辐射源由河北师范大学物理系研制;电磁辐射测试仪:型号:LZT-1150,北京龙震天科技有限公司;电子式定时器型号:ETC-63A,慈溪自成电子有限公司;日本Olympus全能显微镜BX-53;德国Leica切片机、展片仪。
  4 动物分组模型制备
  40只SD雄性大鼠正常饲养1周后,随机分为正常组、模型组、水飞蓟宾组和西洋参组,每组各10只。正常组:每天将大鼠置辐射笼4h,不辐射;模型组、水飞蓟宾组和西洋参组:将大鼠置于辐射笼内,辐射源置辐射笼中央,设定自动开关,每天辐射(频率为900MHz,平均功率密度为370μW/cm2)4h后正常饲养,连续12天。实验过程中均无大鼠死亡,以大鼠肝HE发生形态学改变判定造模成功。
  5 干预方法
  辐射同时,水飞蓟宾组和西洋参组大鼠每天灌胃水飞蓟宾和西洋参混悬液(1mL/200g,均相当于临床人用药剂量10倍)。正常组、模型组每天灌胃等容积生理盐水,连续12天。
  6 检测指标及方法
  大鼠于干预后禁食12h,10%水合氯醛腹腔麻醉后立即选取相同部位肝组织(约0.3cm×0.5cm×0.5cm)置于4%多聚甲醛溶液固定,用于组织形态和免疫组化观察;另取部分肝组织(约1cm×0.5cm×0.5cm)置液氮冷冻,备测。
  6.1 肝脏组织形态学观察
  肝脏组织经4%多聚甲醛固定24h,再经梯度脱水、透明、浸蜡包埋、切片(5μm),常规HE染色,光学显微镜下观察。
  6.2 肝脏组织MDA、SOD、GSH、GSH-PX含量检测
  采用比色法。取组织块用冰冷的生理盐水漂洗,用眼科小剪尽快剪碎组织块,用组织捣碎机15 000r/min研磨制成10%组织匀浆。按照各指标的说明书采用简便操作法进行。
  6.3 免疫组织化学染色观察大鼠肝细胞Nrf2蛋白表达
  ABC法免疫组织化学染色。HMIAS-2000高清晰度彩色医学图像分析系统,分析其表达平均光密度值(即棕褐色细胞的平均光密度值),平均光密度值越大,表达越强。
  6.4 Western blot检测大鼠肝组织Nrf2蛋白含量
  取肝组织100mg,研磨,裂解,提取蛋白并定量,配制10%的分离胶10mL和5%浓缩胶5mL,插梳子,凝固后上样,每孔中加样品40μg,等量上样,80V恒压下电泳1.5h,电泳使染料至分离胶适当位置,结束电泳。Western blot检测大鼠肝组织Nrf2蛋白含量。采用美国UVP分析仪器,对胶片进行扫描,然后括住每一个条带,系统自动生成灰度值。
  7 统计学方法
  采用SPSS 13.0统计软件,所有数据采用x ±s 表示,计量资料统计用One-WayANOVA ,均数间两两比较行SNK-q 检验。P<0.05为差异有统计学意义。
  结  果
  1 各组大鼠一般状态比较 各组大鼠干预期间一般情况良好,毛色光泽,日常饮食、活动、反应能力未见异常,无大鼠死亡。
  2 各组大鼠肝脏组织形态学比较(图1) 正常组大鼠肝组织结构完整,肝细胞分界清,大小较一致,位于细胞中央,胞质丰富,肝窦排列规则,汇管区清晰。模型组大鼠肝小叶结构完整,肝细胞核缩小或部分消失,核固缩明显。水飞蓟宾组和西洋参组大鼠肝细胞萎缩明显减轻,接近正常。
  3 各组大鼠肝脏组织MDA、SOD、GSH、GSHPX含量比较(表1) 与正常组比较,模型组MDA含量升高(P<0.05),SOD、GSH 含量降低(P<0.05)。与模型组比较,水飞蓟宾组SOD、GSH、GSH-PX含量升高(P<0.05),MDA含量降低(P<0.05);西洋参组MDA含量降低(P<0.05),SOD、GSH 含量升高(P<0.01,P<0.05)。
 

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