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谈天麻素预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

作者:2017-02-14 11:36阅读:文章来源:未知
  长期以来,心肌缺血再灌注损伤( myocardial ischemiareperfusion injury,MIRI) 一直是心血管系统疾病研究的热点之一。临床中冠状动脉痉挛的缓解、心脑血管栓塞再通、心肺手术体外循环后、心脏骤停后心肺脑复苏和器官移植中等都可能发生缺血再灌注损伤。研究表明,在MIRI 时会出现氧自由基增多、钙离子超载等现象,特别是再灌注时常会发生心律失常、心肌顿抑、缺血区无复流的现象,如何减轻MIRI 成为目前研究的热点。缺血预适应( ischemic preconditioning, IPC) 是指反复短暂的心肌缺血对心肌产生保护作用,使心肌对更长时间缺血的耐受性增强。IPC 的研究已证实能对随后的再灌注损伤产生明显的保护作用,但IPC 在临床不能直接用于病人来对抗再灌注损伤,因此寻找药物预处理来对抗MIRI 成为目前的研究热点。
  天麻属兰科植物,为我国常用名贵中药,天麻素是其有效成分之一,化学结构为4-羟甲基苯甲醇-β-D-吡喃葡萄糖苷。天麻素具有增加脑血流量,改善迷路动脉及内耳血供的作用; 对脑缺血再灌注损伤具有保护作用; 可以抑制炎症早期的渗出和阻止血栓形成; 可以降低外周血管阻力、降低血压和增加动脉血管顺应性; 还可增加外周及冠状动脉血流量。鉴于天麻素有着如此广泛的药理学作用,本实验通过天麻素预处理后,结扎大鼠左冠状动脉前降支( left anterior descending coronary,LAD) 的方法建立在体大鼠MIRI 模型,观察天麻素预处理对MIRI 有无保护作用并探讨其可能机制,从而为临床寻找更有效的心肌保护药物提供参考。
  1 材料
  1. 1 实验动物与分组
  选用63 只健康成年SPF 级SD 大鼠( 安徽省实验动物中心) ,雌雄不拘,( 230 ± 10) g,随机分为假手术组、生理盐水组、0. 1 g·kg - 1 低浓度天麻素组、0. 2 g·kg - 1 中浓度天麻素组、0. 4 g·kg - 1 高浓度天麻素组、0. 02 g·kg - 1维拉帕米组。选用10 只健康成年SPF 级SD 大鼠分为正常对照组和天麻素组进行心肌细胞内钙成像测定。
  1. 2 主要仪器及试剂
  BL - 420E 生物机能实验系统、动物呼吸机( 成都泰盟科技有限公司) ; SpectraMax 190 酶标仪( MolecularDevices 公司) ; 激光共聚焦显微镜( 德国徕卡公司) ; 天麻素( 批号: 20100801,纯度: 99. 2%,江苏宝泽堂医药科技有限公司) ; 维拉帕米( 上海信谊药厂有限公司) ; 血清肌酸激酶( CK-MB) 检测试剂盒( 上海晶天生物技术有限公司) ; 乳酸脱氢酶( LDH) 、超氧化物歧化酶( SOD) 、丙二醛( MDA) 检测试剂盒( 南京建成生物工程研究所) ; 毒胡萝卜素( thapsigargin,美国默克公司) ; F - 127、fluo - 8 ( 北京中昊生物技术公司) ; 其他试剂均为分析纯。
  2 实验方法
  2. 1 大鼠MIRI 模型制备
  上午8 时对各组大鼠灌胃给药,连续7 d( 假手术组和生理盐水组均给予生理盐水灌胃) ,于第7天灌胃后取大鼠,建立MIRI 模型: 用10%水合氯醛以3 mL·kg - 1的剂量腹腔注射,麻醉后仰卧位固定于鼠板上,颈部剪毛消毒,暴露气管,做气管插管,连接呼吸机( 呼吸频率60 次·min - 1,潮气量11 mL·次- 1,呼-吸之比为1∶ 2) 。四肢皮下连接电极,标Ⅱ导联接BL - 420E 生物信号采集分析系统连续记录心电图,左侧胸部剪毛,消毒,剪开左侧胸部皮肤,在第3 ~ 4 肋间隙间钝性分离肌肉,拉钩拉开切口,暴露心脏,剪开心包膜,在左心耳下缘处以冠状静脉主干为标志,用5-0 号带针无创缝合线进针,进针深度约1. 5 mm,向肺动脉圆锥方向出针,将一直径约2mm 的塑料管置于结扎部位,连同塑料管一起打活结结扎LAD,缺血成功的标志为Ⅱ导联R 波增宽,ST 段抬高,缺血30 min 后,松开结扎线,再灌注2 h,再灌注成功的标志为抬高的ST 段下降,S 波幅值恢复50%以上。假手术组术中只穿线,不结扎。
  2. 2 心律失常的观察
  各实验组手术操作后即记录正常期、缺血期、再灌注期的心电图,监测心电指标,观察心律失常的发生情况。
  2. 3 血清酶检测
  各组于缺血再灌注2 h 后分别从腹主动脉取血约4 mL,以3 500 r /min - 1 的速度离心10 min,得到大鼠血清,分装,- 20 ℃冰箱储存。按试剂盒说明书检测CK-MB、LDH、SOD 和MDA,用酶标仪测各组吸光度值。
  2. 4 心肌组织形态学变化
  腹主动脉取血后,摘取大鼠心脏,置于体积分数4%福尔马林溶液中固定,在结扎线下方切取左心室前壁心肌组织,脱水、包埋、切片、脱蜡、HE 染色,光学显微镜下观察各组大鼠心肌组织形态学的变化,分析天麻素预处理后对心肌组织形态学的影响。
  2. 5 心肌细胞内钙成像测定
  取正常SD 大鼠10 只,击昏,颈总动脉放血处死,快速摘取心脏,切取2 块左心室前壁心肌组织,体积约为10 × 5 × 0. 8 mm3,作为正常对照组和天麻素组,置于含有0. 02% pluronic F-127、10 μmol·L - 1 Fluo-8 的NPSS 液( 140 mmol·L - 1 NaCl,5mmol·L - 1 KCl,1 mmol·L - 1 CaCl2,1 mmol·L - 1MgCl2,10 mmol·L - 1 glucose,5 mmol·L - 1 Hepes,pH 7. 4) 的四十八孔板中, 37 ℃恒温箱孵育80 min,取出并用无钙Krebs'液( 118 mmol·L - 1 NaCl,4. 7mmol·L - 1 KCl,2. 5 mmol·L - 1 CaCl2,1. 2 mmol·L - 1 KH2PO4,1. 2 mmol·L - 1 MgSO4·7 H2O,25. 2mmol·L - 1 NaHCO3和11. 1 mmol·L - 1 glucose) 冲洗,将其固定于含无钙Krebs'液[( 37 ± 0. 5) ℃,持续供含95% O2、5% CO2的混合气]的浴槽中。正常对照组加入1 μmol·L - 1维拉帕米阻断L 型钙离子通道、4 μmol·L - 1 毒胡萝卜素阻断肌浆网钙泵,20 min 后,加入2. 5 μmol·L - 1CaCl2,通过激光共聚焦显微镜观察细胞内钙荧光强度的变化; 天麻素组加入1 μmol·L - 1维拉帕米、4 μmol·L - 1 毒胡萝卜素, 10 min 后加入1 μmol·L - 1 天麻素,10 min 后,再加入2. 5 μmol·L - 1 CaCl2,观察细胞内钙荧光强度的变化,从而判断天麻素对非选择性阳离子通道的作用。
  2. 6 统计学处理
  实验数据以珋x ± s 表示,采用SPSS17. 0 分析软件进行统计分析,组间比较采用两样本率的卡方检验和独立样本t 检验。
  3 结果
  3. 1 大鼠MIRI
  模型建立成功的心电图除假手术组外,其余各组大鼠结扎LAD 后,可见S 波消失,ST 段明显抬高,再灌注后,ST 段恢复,提示MIRI 模型建立成功,见图1。63 只大鼠在模型建立过程中,有3 只大鼠因心律失常死亡而舍弃,建模成功率大于95%。
  3. 2 天麻素预处理对心律失常发生的影响
  与假手术组相比较,生理盐水组在MIRI 后心律失常发生率为66. 7%,差异有显著性( P < 0. 01) ,说明缺血再灌后心律失常发生率很高; 中、高浓度天麻素组和维拉帕米组与生理盐水组相比较,差异均有显著性( P < 0. 05 ) ,说明天麻素预处理后能降低MIRI 后心律失常的发生。
  3. 3 天麻素预处理对血清LDH、CK-MB 的影响
  生理盐水组与假手术组相比较,血清LDH 和CK-MB 含量明显增高,差异均有显著性( P <0. 01) ,说明MIRI 模型建立成功。中、高浓度天麻素组和维拉帕米组与生理盐水组相比较,血清LDH和CK-MB 含量减少,差异均有显著性( P < 0. 05) ;且中、高浓度天麻素组与维拉帕米组相比较差异无显著性( P > 0. 05) ,提示天麻素作用与阳性药物一致,能减轻MIRI 时的心肌损伤,对心肌组织有一定的保护作用; 低、中、高浓度天麻素组两两比较,差异无显著性( P > 0. 05) ,表明其作用无剂量依赖性。
  3. 4 天麻素预处理对血清SOD、MDA 的影响
  与假手术组相比较,生理盐水组血清SOD 含量降低,差异有显著性( P < 0. 05) ; 各给药组与生理盐水组相比较,SOD含量均明显增高,差异均有显著性( P < 0. 05) ; 且各浓度天麻素组与维拉帕米组相比较,差异无显著性( P > 0. 05) ,提示天麻素预处理对心肌的保护作用可能与增加血清中SOD 含量从而利于清除氧自由基有关; 低、中、高浓度天麻素组两两比较,差异无显著性( P > 0. 05) ,表明其作用无剂量依赖性。
  与假手术组相比较,生理盐水组血清MDA 含量明显增高,差异有显著性( P < 0. 01) ,说明MIRI时MDA 含量增高; 中、高浓度天麻素组和维拉帕米组与生理盐水组相比较,MDA 含量减少,差异有显著性( P < 0. 05) ; 且中、高浓度天麻素组与维拉帕米组相比较差异无显著性( P > 0. 05) ,提示天麻素预处理能减轻心肌损伤,对心肌组织有一定的保护作用; 低、中、高浓度天麻素组两两比较,差异无显著性( P > 0. 05) ,表明其作用无剂量依赖性。
  3. 5 天麻素预处理对心肌组织形态学的影响
  经HE 染色后可见假手术组心肌细胞排列整齐,胞膜完整,横纹清晰,界限清晰,胞质、胞核着色均匀,见图2A; 生理盐水组心肌细胞排列不整齐,横纹不清晰,界限不清,胞质、胞核着色不均匀,有明显水肿,毛细血管扩张,有大量红细胞、炎症细胞浸润,见图2B; 低浓度天麻素组心肌细胞排列不整齐,横纹不清晰,界限不清,胞质、胞核着色不均匀,部分区域有水肿,有大量红细胞、炎症细胞浸润,见图2C; 中、高浓度天麻素组和维拉帕米组心肌细胞排列较整齐,横纹较清晰,界限较清楚,胞质、胞核着色较均匀,无明显水肿,有少量红细胞、炎症细胞浸润,见图2D、2E、2F。组织形态学结果提示,天麻素预处理后对MIRI 的心肌细胞有一定的保护作用。
  3. 6 心肌细胞内钙成像测定
  正常对照组加入2. 5 μmol·L - 1 Ca2 + 后,心肌组织荧光强度明显增强,表明细胞外Ca2 + 通过非选择性阳离子通道进入细胞内,而天麻素组加入Ca2 +后心肌组织荧光强度增加程度降低,两者相比差异有显著性( P < 0. 05,n = 10) ,提示天麻素对钙库操控的钙内流具有一定的抑制作用,能抑制细胞膜上受钙库操控的非选择性阳离子通道的Ca2 + 内流。
  4 讨论
  缺血再灌注是导致心肌损伤的一个复杂的病理生理过程,主要与再灌注时氧自由基增多、钙超载、炎症细胞浸润等过程有关。MIRI 时由于心肌细胞膜的损伤常会导致细胞内LDH、CK-MB 外漏,所以临床常把两者作为判断心肌损伤的特异性指标,本实验发现,天麻素预处理后LDH、CK-MB 的含量均显著降低,表明天麻素预处理能保护心肌细胞膜的完整性,减少酶的外漏,增强心肌细胞对抗MIRI 的能力。
  SOD 则是机体内一种重要的抗氧化酶,MIRI 时由于SOD 清除氧自由基能力有限,使氧自由基大量积累,从而造成心肌损伤,同时使MDA 含量升高,已有研究发现天麻素可提高大鼠离体心肌SOD 含量和降低MDA 含量,本实验同样发现天麻素预处理后,能使血清中SOD 含量增加,MDA 含量减少,提示天麻素预处理对心肌的保护作用可能与增加SOD 含量,增强其清除氧自由基能力有关。
  MIRI 时由于氧自由基的产生和K + 外流,会引起炎症细胞浸润、炎症细胞因子表达增加,使周围组织细胞受到损伤,本实验发现,天麻素预处理后MIRI 时心肌细胞形态结构变化不明显,组织间隙中红细胞、炎症细胞数量明显减少,从形态学的角度证明天麻素有明显的心肌保护作用。
  实验发现,天麻素预处理能显著降低MIRI时心律失常的发生率,对心肌具有一定的保护作用。这种保护作用可能与天麻素抑制MIRI 时的Ca2 + 超载有关。我们进一步通过激光共聚焦显微镜技术观察心肌细胞钙荧光强度的变化来分析天麻素对MIRI 时心肌细胞钙超载的影响。在心肌组织中先加入毒胡萝卜素阻断细胞内钙库膜上钙泵,使钙库清空,再加入维拉帕米抑制L型钙离子通道,最后加入Ca2 + ,若能使心肌组织荧光强度增强,则说明钙离子通过非选择性阳离子通道进入心肌细胞内。结果发现,天麻素组在加入Ca2 + 后,心肌组织荧光强度增加程度明显减弱,表明天麻素能通过抑制非选择性阳离子通道来抑制钙库操控的Ca2 + 内流,从而抑制心肌细胞内Ca2 + 超载。
 

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