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谈双波长RP-HPLC 同时测定骨刺膏渗漉液中马钱子碱、士的宁和乌头碱的含量

作者:2017-02-14 11:35阅读:文章来源:未知
  骨刺膏为甘肃省中医院医院制剂( 批号甘药制字Z11012102) ,由制马钱子、制草乌、川芎及木瓜等7 味中药组成,外用具有活血化瘀、活利关节的功效,用于治疗各类骨质增生性关节疼痛等。骨刺膏为中药外用膏剂,方中制马钱子和制草乌用酸溶液渗漉,浓缩后经其他工序研制而成。制马钱子具有通络止痛、散结消肿之功效,主要成分为生物碱类的马钱子碱和士的宁,二者均为具有竞争性的甘氨酸突触后膜抑制作用拮抗剂。制草乌具有祛风除湿、温经止痛的功效,主要含二萜类乌头碱。乌头碱既是有效活性成分,也是毒性成分,在外用镇痛方面具有独到之处,镇痛作用强且连续用药不易产生耐受现象。制马钱子和制草乌均为毒性药材,因此需对二者进行严格限量。制马钱子和制草乌中生物碱类成分的单独测定方法已有较多报道。但在同一色谱条件下同时测定两种药材中马钱子碱、士的宁和乌头碱含量的方法尚未见报道。故本实验拟建立RP-HPLC 同时测定制马钱子和制草乌中马钱子碱、士的宁和乌头碱含量的方法,为提升骨刺膏的质量标准提供实验依据。
  1 材料
  2695 型高效液相色谱仪( 1525 型四元泵,2487型紫外检测器,717 型自动进样器,美国Waters 公司) ,NW 型超纯水处理器( 上海力康生物医疗科技控股有限公司) ,AR124CN 型电子天平( 美国奥豪斯公司) 。马钱子碱、士的宁、乌头碱对照品( 中国食品药品检定研究院,批号分别为110706-200505, 110705-200306,110789-200404 ) ,骨刺膏渗漉液( 批号20130604,20130621,20130705,甘肃省中医院制剂室提供) ,乙腈为色谱醇,水为纯化水,其余试剂均为国产分析纯。
  2 方法与结果
  2. 1 色谱条件Symmetry C18色谱柱( 4. 6 mm ×250 mm,5 μm) ,流动相乙腈( A) -水( B) ( 含0. 01mol·L - 1磷酸二氢钾溶液,用磷酸调节pH 3) 梯度洗脱( 0 ~ 22 min,11% A; 22 ~ 23 min,11% ~ 33% A;23 ~ 36 min,33%A; 36 ~ 37 min, 33% ~ 11%A; 37 ~40 min, 11%A) ,流速1. 0 mL·min - 1,柱温室温,检测波长为乌头碱235 nm,马钱子碱和士的宁260nm,进样量20 μL。
  2. 2 混合对照品溶液的制备精密称取马钱子碱、士的宁和乌头碱对照品适量,分别加三氯甲烷配置成0. 110, 0. 165, 0. 200 g·L - 1 的对照品贮备液。依次精密吸取上述对照品贮备液3,3,1 mL 置于25 mL量瓶中,加三氯甲烷稀释至刻度,摇匀,即得。
  2. 3 供试品溶液的制备精密量取骨刺膏渗漉液25 mL 置锥形瓶中,用10% 氢氧化钠溶液调节渗漉液pH 10,转移至分液漏斗中,分别用25,25,15 mL的乙醚萃取,合并乙醚层,挥干溶剂,残渣用三氯甲烷溶解并转移至5 mL 量瓶中,加三氯甲烷稀释至刻度,摇匀,经0. 45 μm 微孔滤膜滤过,即得。
  2. 4 阴性样品溶液的制备按骨刺膏的处方与制备方法制备不含制草乌和制马钱子药材的骨刺膏渗漉液,作为阴性样品。取阴性样品25 mL,按2. 3 项下方法制备供试品溶液,即得。
  2. 5 线性关系考察精密量取混合对照品溶液2,4,6,8, 10, 20 μL,按2. 1项下色谱条件测定,以峰面积积分值为纵坐标,进样量为横坐标,得马钱子碱、士的宁、乌头碱回归方程分别为Y = 3. 726 × 106X +2. 700 × 104 ( r = 0. 999 2 ) ,Y = 8. 038 × 105X + 8 488. 84( r = 0. 999 0) ,Y = 9. 655 × 105X + 2 009. 22( r = 0. 999 5) ,线性范围依次为0. 026 4 ~ 0. 264,0. 039 6 ~ 0. 396,0. 016 ~ 0. 160 μg。
  2. 6 精密度试验精密量取同一混合对照品溶液,按2. 1 项下色谱条件连续进样6 次,计算马钱子碱、士的宁和乌头碱峰面积值的RSD 分别为1. 5%,0. 94%, 2. 0%,表明仪器精密度良好。
  2. 7 重复性试验取骨刺膏渗漉液( 批号20130705) 6 份,按2. 3 项下方法制备供试品溶液,按2. 1 项下色谱条件测定,计算马钱子碱、士的宁和乌头碱平均质量浓度分别为1. 26, 1. 90, 0. 76 mg·L - 1,RSD 分别为1. 3%, 0. 9%, 2. 2%。
  2. 8 稳定性试验取同一供试品溶液,室温放置,分别在0,2,4,6,8,10,12,24 h 按2. 1 项下色谱条件测定,计算马钱子碱、士的宁和乌头碱峰面积的RSD 分别为1. 8%,1. 5%,2. 1%,表明供试品溶液在24 h 内基本稳定。
  2. 9 加样回收率试验精密量取已知含量的样品溶液( 批号20130705) 6 份,每份25 mL,置具塞锥形瓶中,各精密加入2. 2 项下混合对照品溶液2. 50 mL,按2. 3 项下方法制备供试品溶液,按2. 1 项下色谱条件测定,计算回收率。
  2. 10 样品测定取3 批骨刺膏渗漉液,每批平行3 份,按2. 3 项下方法制备供试品溶液,按2. 1 项下色谱条件测定,采用外标法计算样品中马钱子碱、士的宁和乌头碱的平均质量浓度分别为1. 29,1. 92,0. 79 mg·L - 1,RSD 依次为1. 6%, 1. 0%,1. 9%。
  3 讨论
  检测波长考察时,将马钱子、士的宁、乌头碱对照品溶液和混合对照品溶液在200 ~ 760 nm 进行全波长扫描,结果显示马钱子碱、士的宁的λmax依次为260, 254 nm,混合对照品溶液在260 nm 处呈强吸收,乌头碱在260 nm 亦有吸收,但吸收强度较弱且吸收值低,在235 nm 附近有最大吸收,故选择马钱子和士的宁的检测波长260 nm,乌头碱的检测波长235 nm。
  文献报道马钱子碱和士的宁的含量测定采用乙腈-0. 01 mol·L - 1 庚烷磺酸钠与0. 02 mol·L - 1 磷酸二氢钾等量混合溶液( 用10%磷酸调节pH 2. 8) 为流动相,检测波长260 nm。乌头碱类常选择乙腈-0. 2%冰乙酸( 加三乙胺调节pH 6. 25) ( 29 ∶ 71) ,40 mmol·L - 1 乙酸铵溶液-乙腈梯度洗脱及甲醇-0. 05%磷酸溶液( 含0. 04% 三乙胺) ( 68∶ 32) 为流动相。结合预试验分析,本文采用乙腈-0. 01mol·L - 1磷酸二氢钾溶液在pH 3 的弱酸性条件下梯度洗脱,结果显示样品中3 种成分可同时检出,峰型对称,干扰组分少,分离度好。
  制草乌中乌头碱、次乌头碱和新乌头碱等为有效成分,但也是毒性成分,治疗剂量与中毒剂量接近,安全范围小。中药的临床疗效是多组分协同作用的结果,尽可能多地测定其所含成分是实现中药复方有效质控的有效途径。李智勇等对癌痛巴布剂进行含量测定时,以君药草乌中乌头碱、次乌头碱和新乌头碱为检测指标,采用HPLC 同时对这3 种成分进行测定。本文将马钱子和草乌中主要成分在同一色谱条件下同时检出,可为全面提升骨刺膏的质量水平提供参考。
 

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