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谈匙羹藤对胰岛素抵抗小鼠脂肪组织蛋白激酶B 的影响

作者:2017-02-14 11:35阅读:文章来源:未知
  匙羹藤又名武靴藤、金刚藤,是一种主要分布于我国两广地区的传统草药,性苦味平,具有清热解毒之功效,传统用于治疗风湿关节痛,痈疖肿毒等,近年来,临床报道其具有降糖调脂的作用,实验研究也初步验证了其可通过改善胰岛素抵抗(InsulinResistance,IR) 进而防治2 型糖尿病,且与激活脂肪组织PI3κ 信号通路有关。蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB) 是脂肪组织中胰岛素介导葡萄糖转运PI3κ 信号通路中重要的调节因子,大量实验研究证实了脂肪组织PKB 表达异常以及其磷酸化形式的表达或磷酸化程度的异常与IR 形成与发展密切相关[3]。本研究以IR KKAy 小鼠为研究对象,观察匙羹藤对小鼠IR 的作用以及对脂肪组织中PKB 表达以及其磷酸化(P-PKB)形式的含量以及磷酸化比率的影响。
  1 材料
  1.1 动物
  SPF 级雄性6~7 周龄,雄性KKAy 小鼠18 只,体质量(26±3)g;同周龄雄性C57BL/6J 小鼠9 只,体质量(22±3)g,购自中国医学科学院动物研究所,许可证号:SCXK 京2009-0004。动物饲养于北京中医药大学实验动物中心SPF 实验室,动物室内设置12 h 昼夜循环,并维持室温在(23±2)℃,湿度在(55±10)%,动物采用单笼喂养,期间自由摄食、饮水,KK 鼠料购自于中国医学科学院动物研究所。
  1.2 药物与试剂
  匙羹藤提取物由北京中医药大学中药学院提供:匙羹藤生药饮片5 kg,加水煎煮3 次,料液比分别为1∶10、1∶10、1∶8,煎煮时间分别为:1.5、1.5、1 h,分别过滤合并滤液,滤液减压浓缩至稠膏,70℃真空干燥,粉碎,过80 目筛,得匙羹藤提取物0.33 kg;盐酸吡格列酮片:北京太洋药业有限公司,批号:H20040267;小鼠胰岛素放射免疫试剂盒(Merckmillipore 公司);血糖试纸(日本爱科来试剂公司);PKB 抗体(CST 公司,批号:#4685);P-PKB(Ser473)(CST 公司,批号:#4060);P-PKB(Thr308)(CST 公司,批号:#4056);Trizol 试剂盒(Invitrogen 公司);PCR 引物(生工生物工程上海有限公司);RealtimePCR 扩增试剂盒(中原领先科技有限公司)。
  1.3 主要实验仪器
  3κ30 型低温高速离心机(美国Sigma 公司);稳压稳流电泳仪(美国Bio-Rad 公司),垂直电泳槽(美国Bio-Rad 公司),半干转电转印仪(美国Bio-Rad 公司),血糖仪(日本爱科来公司),Real-TimePCR 仪(美国ABI7500),核酸紫外分光光度计(德国Biophotometer 公司)。
  2 方法
  2.1 动物分组及给药
  雄性6~7 周龄KKAy 小鼠18 只,适应性喂养1周后,剪尾取血,测随机血糖值≥13.9 mmol·L-1 者入选,18 只全部入选。按照体质量随机分组,分为模型组(DM)9 只,匙羹藤提取物组(GS)9 只。另取9只雄性C57BL/6J 小鼠作为空白对照组(NC)。每日GS 组小鼠按照2.5 g·kg-1 灌胃给药,共8 周,DM组、NC 组小鼠灌胃等体积的无菌水。
  2.2 观察指标及检测方法
  2.2.1 空腹血糖(Fasting Plasma Glucose,FPG)、空腹血清胰岛素(Fasting Serum Lisulin,Fins)末次给药后小鼠禁食不禁水(00∶00~08∶00)8 h后测定空腹血糖; 摘眼球取血后静置3 h,3 500rpm 分离血清,采用放射免疫法测定空腹血清胰岛素水平。
  2.2.2 胰岛素敏感指数(Insulin Sensitivity Index,ISI)的检测
  采用李光伟法,ISI=1/(FPG×Fins)。
  2.2.3 蛋白免疫印迹法检测PKB、P-PKB(Ser473)、P-PKB(Thr 308)、3’磷酸肌醇依赖的激酶1(3-Phosphoinositide-Dependent Protein Kinase-1, PDK1)蛋白表达提取蛋白,采用Bradford 法测定蛋白含量,蛋白变性→SDS-PAGE 电泳(10%SDS-PAGE 分离胶,5%浓缩胶分离蛋白,BIO-RAD 电泳板)→转印→封闭→一抗(1∶1 000 比例稀释)孵育(4℃过夜)→二抗(1∶10 000 比例稀释)孵育,室温放置1 h→清洗:TTBS 洗3 次,每次5 min→ECL 发光→用IPP 软件对扫描图象的目的条带进行灰度分析。
  2.2.4 实时荧光定量PCR 法检测PTEN mRNA
  实验结束后,拉颈处死各组小鼠,在冰上迅速取出附睾脂肪垫,并置入液氮中以备检测用。
  ①总RNA 提取:在预冷的研钵中加入液氮进行快速研磨组织,并用Trizol 一步法提取脂肪组织总RNA,并以核酸紫外分光光度计法检测RNA 的浓度与纯度。
  ②引物序列:磷酸酶和张力蛋白同源物基因(Phosphatase and Tensin Hom olog Deleted on ChromosomeTen,PTEN)上游引物:5’-CTGCAGAGTTGCACAGTATCC-3’,下游引物:5’-TTACACCAGTCCGTCCCTTT-3’,155 bp;参照基因GAPDH 上游引物:5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’,下游引物:5’-CAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’,154 bp。③RNA的体外反转与实时荧光PCR:采用25 μL 反转录体系,42℃孵育60 min→70℃ 10 min,将cDNA 加入20 μL Real -Time PCR 体系,94℃ 预变性1min,94℃ 15 s、60℃ 34 s、72℃ 15 s 40 个循环,72℃ 10 min,用相对定量2-△△CT 法分析结果。
  2.2.5 统计学方法
  采用SPSS 17.0 统计软件包处理数据,数据以平均值±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析方法,P<0.05 为差异有统计学意义,P<0.01为差异具有显著性。
  3 结果
  3.1 匙羹藤对KKAy 小鼠FPG、Fins、ISI 的影响DM 组小鼠在给药过程中死亡1 只,可能由于灌胃操作失败导致药液进入肺脏,造成肺炎所致,__故最后模型组有8 只鼠进入统计。给药8 周后,与NC 组相比,DM 组FPG、Fins 水平显著升高(P <0.01),ISI 显著降低(P<0.01);与DM 组相比,GS组FPG、Fins 水平显著降低(P<0.01),ISI 显著升高(P<0.01)。
  3.2 匙羹藤提取物对KKAy 小鼠脂肪组织PKB、PPKB(Ser473)、P-PKB(Thr308)蛋白相对含量的影响蛋白表达量:药物干预8 周后,与NC 组相比,DM 组脂肪组织PKB 蛋白相对含量变化不明显,PPKB(Ser473)、P-PKB(Thr308)蛋白相对含量显著降低(P<0.01)。与DM 组相比,GS 组脂肪组织PKB 蛋白相对含量无差异性改变,P-PKB(Ser473)蛋白相对含量明显升高(P<0.05),P-PKB(Thr308)蛋白相对含量明显升高(P<0.05)。
  磷酸化比率:药物干预8 周后,与NC 组相比,DM 组脂肪组织P-PKB (Ser473)/PKB 以及P-PKB(Thr308)/PKB 均显著降低(P<0.01),与DM 组相比,GS 组脂肪组织P-PKB (Ser473)/PKB 显著升高(P<0.01),而P-PKB (Thr308)/PKB 仅有升高的趋势。
  3.3 匙羹藤对KKAy 小鼠脂肪组织PDK1 蛋白相对含量的影响药物干预8 周后,与NC 组相比,DM 组脂肪组织PDK1 蛋白相对含量显著升高(P<0.01),与DM组相比,GS 组脂肪组织PDK1 蛋白相对含量显著降低(P<0.01)。3.4 匙羹藤对KKAy 小鼠脂肪组织PTEN mRNA的影响与NC 组相比,DM 组脂肪组织PTEN mRNA 表达量无明显变化,与DM 组相比,GS 组脂肪组织PTEN mRNA 表达量降低(P<0.05)。
  4 讨论
  KKAy 小鼠是一种具有严重胰岛素抵抗特征的自发型2 型糖尿病的黄色皮毛小鼠,其具有高血糖、肥胖、高血糖、高胰岛素血症、血脂紊乱等代谢异常综合征的特征,是研究胰岛素抵抗以及2 型糖尿病的理想动物模型。有研究指出,KKAy 小鼠脂肪组织中存在胰岛素介导PI3κ 信号通路转导障碍,且阻滞该条通路正常传导的主要原因是蛋白激酶B磷酸化发生异常的病理改变,故本实验以KKAy小鼠作为干预对象讨论匙羹藤抗脂肪组织IR 作用以及作用机制。
  匙羹藤是我国两广地区常用的抗糖尿病单味中药,临床验证其有良好的降糖降脂作用,在药效学方面也已经验证了其对实验性高血糖小鼠的降糖作用。早期的研究提示骨骼肌是IR 存在的主要部位,但是现在越来越多的研究认为脂肪组织是IR 产生的始发部位。尤其是内脏脂肪组织在IR和代谢综合征发生、发展过程中起着非常重要作用,因此有效的抗脂肪组织IR 的发生发展对于IR 的防治有着积极的意义。在脂肪细胞内,胰岛素介导的PI3κ/PKB 信号转导通路障碍是脂肪组织发生IR最常见的发病机制。PKB(又称AKT)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是PI3κ/PKB 途径中PI3κ 的下游信号分子,在胰岛素的诱导下,此条途径中的上游信号逐级活化,引发PKB 的磷酸化位点激酶域的Thr308 和调节域的Ser473 磷酸化随之被活化,随后从膜上脱落下来,活化或抑制下游的信号蛋白,发挥其介导葡萄糖转运等代谢效应。Schubert K M等验证了Ser473 磷酸化对PKB 活性的影响,其采用磷酸酶诱导Ser473 去磷酸化,结果显示PKB 几乎完全失去活性,可见Ser473 位点的磷酸化在PKB的活化中必不可少。PTEN是一种特异性蛋白酪氨酸磷酸酶,可减弱PI3κ/PKB 信号通路的生理作用[13]。PDK1 是一种Ser/Thr 激酶,可结构性激活PKB,在PDK 的催化下PKB 第Thr308 磷酸化位点被激活,随之PKB 的第Ser473 位点也被磷酸化后PKB 随即脱离质膜,进入胞质,同时PDK1 和PKB 的自动磷酸化也可能与Ser473 的磷酸化有关。
  本实验结果显示:①匙羹藤能够增加具有IR特征的KKAy 小鼠胰岛素敏感指数,改善胰岛素抵抗;②在PKB 的表达及磷酸化的影响方面,虽然匙羹藤对脂肪组织中PKB 的表达没有影响,但是可增加Thr308 位点磷酸化蛋白的相对含量,以及显著增加第473 位点丝氨酸磷酸化蛋白的相对含量以及提高其磷酸化比率。由结果推论得知:匙羹藤可改善KKAy 小鼠IR,其主要是通过增加PKB 的Ser473位点磷酸化蛋白相对含量进而提高其磷酸化比率以及Thr308 位点磷酸化蛋白相对含量,以实现对PKB 的激活,进而干预胰岛素PI3κ 信号通路转导改善IR;③在对PKB 磷酸化的调节作用方面:与正常组相比,PDK1 在KK-Ay 小鼠体内含量增加,推测可能是因为在IR 状态下,第308 位苏氨酸的磷酸化程度减弱,PDK-1 代偿性增加以补偿,经匙羹藤干预后PDK-1 含量降低,推测可能是Thr308 位点磷酸化蛋白相对含量增加, 其磷酸化得以改善,PDK-1 代偿作用减弱引起的降低,由此推测匙羹藤增加Thr308 位点磷酸化并非是通过调节PDK1的表达实现,可能是通过对Thr308 位点磷酸化的直接促进作用实现。对于PI3κ/PKB 信号通路的负调节因子PTEN 的基因表达量,虽然模型组小鼠PTEN 的基因表达量与正常组小鼠并没有表现出差异性改变,但是匙羹藤给药组与模型组小鼠相比,其PTEN 的基因表达量减少,表明匙羹藤对PI3κ/PKB 信号通路的调节机制与降低PTEN 的抑制作用相关。
  综上,匙羹藤可通过增加脂肪组织中P-PKB(Ser473)蛋白相对含量,增强Ser473 位点磷酸化水平,以及增加P-PKB(Thr308)蛋白相对含量,进而激活PKB,改善IR。
 

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