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谈青藤碱乳酸羟基乙酸共聚物-水溶性维生素E纳米粒的制备及处方工艺优化

作者:2017-01-09 16:04阅读:文章来源:未知
  青藤碱(Sinomenine,SIN)是从中药青风藤中提取的生物碱单体,临床多用其盐酸盐,具有明显抗炎、抗免疫、镇痛等药理作用。国内已有盐酸青藤碱片、盐酸青藤碱注射液等用于临床,并有脂质体、微乳、凝胶、微球等新剂型在研究中。陈伟毅等研究发现,青藤碱对肿瘤细胞增殖也有较强的抑制作用,能够抑制多种恶性肿瘤细胞的生长。但由于青藤碱生物半衰期较短,临床治疗一般需长期口服,且用药剂量较大,可引起皮疹、胃肠道等不良反应,加之对光、热均不稳定,限制了其应用。
  纳米粒(Nanoparticles,NPs)是一种稳定性好、毒性较小的靶向制剂载体,其能改变药物在体内的药动学特征,增加药物在靶器官的分布量,从而提高疗效、降低毒副作用[4]。目前用于制备纳米粒的高分子材料较多,本研究采用大连医科大学药剂学教研室自制的材料乳酸羟基乙酸共聚物-水溶性维生素E(Polylactic-co-glycolic acid/D-α-tocopherol polyethylene glycol1000 succinate,PLGA-TPGS)为载体,将青藤碱制成纳米粒,即青藤碱PLGA-TPGS 纳米粒(SPTN)。由于材料的包载作用,可望提高青藤碱的体外稳定性,减慢其释放,使其更好地发挥对疾病的治疗作用。由于青藤碱的水溶性较强,根据其自身的结构和性质特点,本研究采用超声乳化-溶剂挥发法[7]制备SPTN,以粒径、载药量和包封率为评价指标,通过单因素考察和正交设计试验优化其处方工艺,为制备青藤碱新制剂提供试验依据。
  1 材料
  1.1 仪器
  1200 型高效液相色谱仪(美国Agilent 公司);JY92-ⅡN超声波细胞粉碎机(宁波新芝科技股份有限公司);NanoZS90 激光粒度仪(英国Marlvern 公司);RW20 数显电动搅拌机(日本IKA 公司);SCPTOH型离心机(日本Hitachi 公司,离心半径:13.5 cm);FD-1C 冷冻干燥机(北京德天佑科技发展有限公司);MS105DU型电子天平(瑞士梅特勒-托利多有限公司,精度:0.01 mg)。
  1.2 药品与试剂
  青藤碱原料药(陕西森弗生物技术有限公司,批号:20130120,纯度:98%);青藤碱对照品(美国Sigma 公司,批号:608-05-1,纯度:99%);PLGA-TPGS(大连医科大学药剂学教研室自制,批号:20121018);TPGS(美国Eastman 化学公司,批号:20120910,纯度:99%);甲醇(美国Tedia 公司,批号:907900,色谱纯);其余辅料均为药用规格,所用试剂均为分析纯。
  2 方法与结果
  2.1 粒径的测定
  称取干燥的SPTN 适量,加入4 ml 去离子水中,超声分散后形成纳米粒混悬液,用激光粒度仪测定其平均粒径。2.2 色谱条件色谱柱为Hypersil C1(8 250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为甲醇-10 mmol/L 磷酸二氢钠(38 ∶62,V/V),流速为1.0 ml/min;检测波长为262 nm[8];柱温为30 ℃;进样量为20 μl。
  2.3 系统适用性试验
  分别精密称取青藤碱对照品适量,用甲醇溶解制备成质量浓度为40 μg/ml 的溶液;再精密称取SPTN 适量,用丙酮溶解后减压回收丙酮,残渣加入流动相涡旋使溶解,制备成质量浓度约为40 μg/ml的溶液。分别按照“2.2”项下色谱条件进样,记录色谱。结果表明,青藤碱的保留时间约为5.9 min,理论板数以青藤碱计不低于3 000,分离度符合要求。
  2.4 标准曲线的制备
  精密称取干燥至恒质量的青藤碱对照品0.025 g,置于50ml 量瓶中,加甲醇适量,振摇使溶解,再加甲醇定容至刻度,得质量浓度为500 μg/ml 的对照品贮备液。分别精密量取对照品贮备液100、200、400、800、1 600、3 200、6 400 μl,置于10 ml 量瓶中,加甲醇定容至刻度,配制成质量浓度依次为5、10、20、40、80、160、320 μg/ml 的系列对照品溶液。按照“2.2”项下色谱条件进样,记录峰面积,以峰面积(A)为纵坐标、质量浓度(c)为横坐标进行线性回归分析,得回归方程为A=15.88c-0.581 8(r=0.999 9,n=7)。结果表明,青藤碱检测质量浓度在5~320 μg/ml范围内与峰面积呈良好线性关系。
  2.5 检测限与定量限考察
  将已知质量浓度的对照品溶液稀释,分别以信噪比为3 和10 时对应的质量浓度为本试验条件的检测限和定量限。结果表明,青藤碱的检测限为0.2 μg/ml、定量限为0.6 μg/ml。
  2.6 回收率试验
  精密称取SPTN(批号:20130301)3.00 mg,共9 份,用适量丙酮溶解后减压回收丙酮,加入适量流动相涡旋混匀,转移至10 ml 量瓶中,每3 份分别精密加入500 μg/ml 青藤碱对照品贮备液600、2 400、3 800 μl,再用流动相定容至刻度。按照“2.2”项下色谱条件进样,记录峰面积,计算回收率。
  2.7 精密度试验
  精密量取青藤碱对照品贮备液适量,加甲醇配制成质量浓度分别为32、40、48 μg/ml 的对照品溶液各1 份,按“2.2”项下色谱条件进样,每日测定5 次,考察日内精密度;另每日同一时间进样,连续测定5 d,考察日间精密度。结果峰面积的日内RSD 分别为1.2% 、1.1% 、1.0%(n=5),日间RSD 分别为1.3%、1.4%、1.2%(n=5),表明本方法精密度良好。
  2.8 重复性试验
  精密称取SPTN(批号:20130301)4.20 mg,共5 份,分别用适量丙酮溶解后减压回收丙酮,残渣加入适量流动相涡旋使溶解,转移至10 ml 量瓶中,再用流动相定容至刻度。按“2.2” 项下色谱条件进样,测定峰面积。结果RSD 为0.8%(n=5),表明该方法重复性好。
  2.9 稳定性试验
  精密称取SPTN(批号:20130301)3.36、4.20、5.05 mg,各1份,按“2.2.5”项下方法制备成低、中、高质量浓度的样品溶液,分别放置0、1、2、4、6、12、18、24、30 d,照“2.2”项下色谱条件进样,测定峰面积。结果RSD分别为1.6%、1.4%、1.5%(n=9),表明样品溶液在30 d 内稳定。
  2.10 载药量和包封率的测定
  分别精密称取SPTN(批号:20130301)4.20 mg,共6 份,按“2.8”项下方法制备成溶液,照“2.2”项下色谱条件进样,测定峰面积,计算含量。按公式计算载药量和包封率:载药量(%)=纳米粒中的药物质量/纳米粒取样质量×100%,包封率(%)=纳米粒中的药物质量/制备时的投药质量×100%。
  2.11 综合评分的计算
  以粒径、载药量和包封率为主要评价指标,设定综合评分为30 分,分别为平均粒径10 分(分数=200 nm/平均粒径×10)、载药量10 分(分数=实际载药量/理论载药量×10)、包封率10分(分数=包封率/100%×10)。
  2.12 SPTN的制备
  精密称取青藤碱原料药适量,用2 ml 纯化水溶解;再精密称取PLGA-TPGS 100 mg,用8 ml 乙酸乙酯溶解。200 W超声条件下将青藤碱水溶液滴加到PLGA-TPGS乙酸乙酯溶液中,形成W/O型一级乳;200 W超声条件下将上述乳液滴加到200ml 0.06%TPGS 水溶液(精密称取TPGS 60 mg,纯化水加至100 ml 溶解,即得)中,继续超声6 min,形成W/O/W型二级乳;电动搅拌12 h 充分挥发乙酸乙酯后,20 000 r/min 高速离心15min,去离子水洗3 次,每次20 000 r/min 离心15 min,将离心后的沉淀物用适量去离子水分散均匀,冷冻干燥24 h,得SPTN。
  2.13 单因素考察
  2.13.1 青藤碱与载体的配比将青藤碱与载体PLGA-TPGS以不同比例混合,其他条件同“2.12”项下方法制备成SPTN,考察其粒径、载药量和包封率,计算综合评分。结果显示,青藤碱与载体的配比为3 ∶10 时,综合评分最高,故选择该比例制备SPTN。青藤碱与载体不同配比对SPTN制备的影响。
  2.13.2 TPGS 水溶液的浓度将青藤碱与PLGA-TPGS 以3 ∶10 比例混合,改变乳化剂TPGS 水溶液的浓度,其他条件同“2.12”项下方法制备成SPTN,考察其粒径、载药量和包封率,计算综合评分。结果显示,当TPGS水溶液浓度为0.06 g/100 ml时,综合评分最高,故选择0.06 g/100 ml TPGS 水溶液制备SPTN。不同浓度的TPGS 水溶液对SPTN 制备的影响。
  3 讨论
  药物与载体配比对粒径和载药量影响较大。配比为1 ∶10时,由于包载的药物较少,所以粒径较小,但载药量也很小,不利于临床应用;随着药物与载体配比的增加,药物被包载的较多,粒径增大较明显,而粒径越大,越不利于纳米粒在体内靶器官的分布;当药物与载体配比为3 ∶10 时,载药量、包封率相对较大,而粒径相对较小,故选择该配比为制备SPTN 的最佳配比。
  TPGS 在W/O/W 型复乳中作为二级乳的乳化剂,其浓度对SPTN的形成影响较大。因为乳化剂量越多,粒径越小,被包进复乳中的药物越多,故TPGS 的浓度越低,在外水相中的量就越少,导致粒径增大、载药量减小、包封率降低;但是当TPGS水溶液浓度大于0.06 g/100 ml 时,又由于外水相黏度随着TPGS浓度的增加而增大,产生较大的阻力,不利于W/O型一级乳小液滴在外水相中的分散,粒径反而增大,载药量、包封率也随着减小。故0.06 g/100 ml 的TPGS 水溶液是制备STPN的最佳浓度。
  在制备工艺中,超声功率和时间对SPTN的制备影响也较大。超声功率越高,液滴被分散时的能量越大,SPTN 的粒径越小,包封率和载药量也越高;但超声功率高于200W时,包封率和载药量变化较小。而且超声功率较大时,也增加了小液滴合并碰撞的机会,粒径反而增大;同时功率越大,能量消耗越多,生产成本增大,故选择200 W作为制备SPTN 的超声功率。超声时间越长,SPTN 的粒径越小,在W/O 型一级乳中SIN 水溶液被PLGA-TPGS乳化得越完全,SIN 在PLGA-TPGS中分布得越多,纳米粒越易成形,载药量和包封率越高;但是当超声时间超过6 min 后,同样又增加了小液滴合并碰撞的机会,粒径反而增大;同时超声时间越长,能量消耗越多,也增大了生产成本,而包封率和载药量又没有明显增大,故6 min 为制备SPTN的最佳超声时间。有关SPTN进一步的质量评价、体外对肝癌细胞的抑制作用以及体内药效学等试验有待进一步的研究。
 

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